[发明专利]检测2019-nCoV中orf1ab基因的RT-LAMP试剂盒及其专用引物和应用

权利要求书

1.一种用于检测新型冠状病毒SARS-CoV-2的引物组，其包括具有SEQ ID NO:2、SEQ IDNO:3、SEQ ID NO:4、SEQ ID NO:5和SEQ ID NO:6所示序列的引物。

2.一种用于检测新型冠状病毒SARS-CoV-2的试剂盒，其包含权利要求1所述的引物组。

3.根据权利要求2所述的试剂盒，其中还包含基础反应试剂，所述基础反应试剂包括：10×Thermopol反应缓冲液、MgSO₄、betaine、dNTP，Bst DNA聚合酶，WarmStart RTx反转录酶。

4.根据权利要求2或3所述的试剂盒，其中还包含阳性对照和/或阴性对照；优选地，所述阳性对照包含新型冠状病毒SARS-CoV-2基因组RNA，所述阴性对照为不含新型冠状病毒SARS-CoV-2基因组RNA的反应体系。

5.权利要求1所述的引物组或权利要求2-4任一项所述的试剂盒在体外检测样品中是否存在新型冠状病毒SARS-CoV-2的应用。

6.根据权利要求5所述的应用，其中，所述引物组是用于RT-LAMP反应；

优选地，引物组在每25μl反应体系中的使用浓度为：SEQ ID NO:2、SEQ ID NO:3所示序列的引物的终浓度独立地为2-8pmol，SEQ ID NO:4、SEQ ID NO:5所示序列的引物的终浓度独立地为24-36pmol，SEQ ID NO:6所示序列的引物的终浓度为12-18pmol；

更优选地，引物组在每25μl反应体系中的使用浓度为：SEQ ID NO:2、SEQ ID NO:3所示序列的引物的终浓度独立地为8pmol，SEQ ID NO:4、SEQ ID NO:5所示序列的引物的终浓度独立地为32pmol，SEQ ID NO:6所示序列的引物的终浓度为16pmol。

7.根据权利要求6所述的应用，其中，RT-LAMP反应体系还包含基础反应试剂，所述基础反应试剂包括：10×Thermopol反应缓冲液2.5μl、100mM MgSO₄ 1.5μl、5mM betaine 4μl、10mM dNTP 3.5μl，Bst DNA聚合酶1μl，WarmStart RTx反转录酶0.5μl，ddH₂O补至25μl；

优选地，所述基础反应试剂在25μl反应体系中的使用量为：12.5μl。

8.根据权利要求6所述的应用，其中，检测包括以下步骤：

S1：提取待测样品RNA；

S2：反应体系配制：25μl反应体系包含2μl待测样品RNA、10×Thermopol反应缓冲液2.5μl、100mM MgSO₄ 1.5μl、5mM betaine 4μl、10mM dNTP 3.5μl，Bst DNA聚合酶1μl，WarmStart RTx反转录酶0.5μl，引物加入量为：100μM FIP/BIP引物各0.8μl(终浓度32pmol)，100μM F3/B3所示引物各0.1μl(终浓度4pmol)，100μM LF/LB引物0.4μl(终浓度16pmol)，ddH₂O补至25μl；

S3：将反应体系置62℃-63℃条件下恒温扩增反应45-60min，获得反应液；

S4：结果分析：使用钙黄绿素颜色指示剂或浊度仪对所述反应液进行检测分析。

9.根据权利要求8所述的应用，其中，步骤S3中将反应体系置63℃条件下恒温扩增反应60min。

10.根据权利要求8或9所述的应用，其中，步骤S4中所述结果分析的具体方法为：

当使用钙黄绿素颜色指示剂进行检测时，在反应液中添加1μl的钙黄绿素颜色指示剂，呈现绿色表示待测样品中存在新型冠状病毒SARS-CoV-2(阳性)，呈现橙色表示待测样品中不存在新型冠状病毒SARS-CoV-2(阴性)；

当使用浊度仪进行检测时，浊度上升(0.1)表示待测样品中存在新型冠状病毒SARS-CoV-2(阳性)，浊度无变化表示待测样品中不存在新型冠状病毒SARS-CoV-2(阴性)。