[发明专利]一种用于紫菜赤腐病检测的两重PCR引物组及试剂盒

说明书

本发明属于生物检测技术领域，涉及引物以及检测试剂盒，具体涉及一种用于紫菜赤腐病检测的两重PCR引物组及试剂盒，该引物组包含两组引物对，分别是检测Pythium porphyrae引物对和检测Pythium chondricola引物对。本发明的优点在于：(1)不需要用到测序技术，花费时间和钱财相对少；(2)可以同时完成两种病原的检测，对于两种病原同时存在或者只存在一种的情况均能检测到；(3)通过电泳片段大小即可判断病原，直观迅速。

技术领域

本发明属于生物检测技术领域，涉及引物以及检测试剂盒，具体涉及一种用于紫菜赤腐病检测的两重PCR引物组及试剂盒。

背景技术

紫菜的养殖业是我国的重要的产业，近年来不断地由于养殖规模的不断扩大、环境污染和种质退化等原因，紫菜病害经常发生，其中的赤腐病是影响紫菜品种、产量最严重的病害。我国最早是在1996年报道了赤腐病的情况。据统计，2003年我国紫菜养殖场因为赤腐病的爆发使得紫菜产量降低了25％-30％，特别是在江浙一带更是下降了39％。目前我国对于赤腐病的研究仍较少，缺乏比较全面的赤腐病流行病学数据，因此我国对赤腐病的研究目前还处于初始阶段。

在中国、韩国和日本，赤腐病是影响紫菜收益最主要的病害。赤腐病首先于1947年在日本由Arasaki报道并进行了研究，随后用了30年分离到其病原为卵菌Pythiumporphyrae以及Pythium chondricola。虽然赤腐病的流行病学特征和该病原的生理特征目前已引起广泛关注，但在其侵染机制方面的研究仍然较少。莫照兰等于2016年发现了中国江苏连云港紫菜养殖场赤腐病的一种新的真菌病原——链格孢属。

自此发现的紫菜赤腐病病原有三种，分别为Pythium porphyrae、Pythiumchondricola、链格孢属，其中链格孢属仅有一株，几乎全部为腐霉属的两种菌。

现有的检测技术是通过cox1序列的特异引物扩增，通过序列比对得知其分类。这样整个程序包括样品DNA提取、特异引物PCR扩增、电泳检测、产物序列测定，这就耗费大量的时间和测序的费用，效率低下。

发明内容

目前能引起紫菜叶状体赤腐病的病原主要是腐霉属的两种菌，分别是Pythiumporphyrae和Pythium chondricola，依赖于测序技术针对这两种病原菌的鉴定方法，耗时长花费高。本发明提出了一种用于紫菜赤腐病检测的两重PCR引物组及试剂盒，能够依靠一轮PCR反应根据电泳条带大小即可判断病原种类，而且灵敏度高，可以检测到10个水体中的游动孢子。

为了实现上述目标，本发明采用如下的技术方案：

一种用于紫菜赤腐病检测的两重PCR引物组，其特征在于，该引物组包含两组引物对，分别是检测Pythium porphyrae引物对，目的片段长度在900bp左右，以及检测Pythiumchondricola引物对，目的片段长度在300bp左右，所述检测Pythium porphyrae引物对包括SEQIDNO：1所示的上游引物P-for和SEQIDNO：2所示的下游引物P-rev，所述检测Pythiumchondricola引物对包括SEQIDNO：3所示的上游引物C-for和SEQIDNO：4所示的下游引物C-rev。

其中，优选方案如下：

所述检测Pythium porphyrae引物对和检测Pythium chondricola引物对的摩尔比为1：1。

本发明还提供了一种用于紫菜赤腐病检测的两重PCR试剂盒，其特征在于，含有以下试剂：含有2×ExTaq的PCR反应液12.5uL、权利要求1所述的上游引物P-for和下游引物P-rev各0.5uL、权利要求1所述的上游引物C-for和下游引物C-rev各0.5uL、待测DNA模板1uL、ddH₂O9.5uL，其中各引物的浓度均为0.2uM。

其中，优选方案如下：