[发明专利]一种基于适配体发卡触发超分支滚环扩增的细胞外囊泡检测技术

说明书

本发明公开了一种基于适配体发卡触发超分支滚环扩增的细胞外囊泡检测技术，首先以细胞外囊泡表面蛋白为靶标设计适配体发卡，以及相应的挂锁探针、连接序列和第二引物，通过挂锁探针和连接序列杂交制备环状模板，适配体发卡与细胞外囊泡孵育后，发卡结构打开，从而与环状模板结合，在加入第二引物的情况下触发超分支滚环扩增，形成大量长度梯度的双链核酸，与核酸染料SYBR GreenⅠ结合能够产生强烈的荧光信号，而且荧光信号强弱与细胞外囊泡浓度呈正相关，从而可根据荧光强度定量检测出目标细胞外囊泡，游离的适配体发卡由于无法触发扩增，无需清洗。本发明提供的细胞外囊泡检测技术方法简单，特异性高，且细胞外囊泡免洗，灵敏度高。

技术领域

本发明属于分子生物学技术领域，具体涉及一种基于适配体发卡触发超分支滚环扩增的细胞外囊泡检测技术。

背景技术

细胞外囊泡(Extracelluar Vesicles,EVs)是细胞释放的膜衍生囊泡，根据起源机制和大小主要分为外泌体(30-200nm)、微囊泡(200-1000nm)和凋亡小体(50-5000nm)3种亚群。细胞外囊泡携带和传递重要的信号分子，形成了一种全新的细胞间信息传递系统，与包括肿瘤发生、侵袭和转移在内的多种疾病进程密切相关。以细胞外囊泡作为液体活检的靶标，具有非侵入性、含量丰富、稳定存在、实时检测、信息全面等优势。

滚环扩增是一种等温扩增技术，包括线性扩增和指数扩增(即超分支滚环扩增)，其中超分支滚环扩增效率更高，产物为长度梯度的双链核酸。超分支滚环扩增具有设备简单、灵敏度和特异性高、可以实现多重检测，以及反应温和，不会破坏生物分子结构和功能等优点，在生物传感器中有着广阔的应用前景。

目前报道的细胞外囊泡检测技术在简便性和样本处理上存在一定问题，例如，检测步骤需要反复清洗，导致EVs损失，检测灵敏度低、重复性差，无法满足临床检测的需求。

通过适配体发卡触发滚环扩增的方式，可以免除反复清洗去除多余适配体发卡的步骤，简化操作步骤，缩短检测时间，提高方法重复性，目前已被实验室用于miRNA的检测，但尚无用于细胞外囊泡检测的报道。

发明内容

本发明所要解决的技术问题是针对上述现有技术的不足，提供一种基于适配体发卡触发超分支滚环扩增的细胞外囊泡检测技术。

为实现上述技术目的，本发明采取的技术方案为：一种基于适配体发卡触发超分支滚环扩增的细胞外囊泡检测技术，其特征在于，包括以下步骤：

(1)以目标细胞外囊泡表面蛋白为靶标设计适配体发卡以及相应的挂锁探针、连接序列和第二引物，其中，适配体发卡的3’端和5’端部分序列碱基互补，挂锁探针的3’端和5’端部分序列与连接序列碱基互补，第二引物与挂锁探针部分序列相同；

(2)挂锁探针和连接序列杂交制备环状模板：挂锁探针、连接序列、T4 DNA连接酶缓冲液、T4 DNA连接酶混合孵育；

(3)适配体发卡与细胞外囊泡混合孵育：将PBS缓冲液稀释后的细胞外囊泡与0.2μM 适配体发卡室温摇床孵育1h，转速为100rpm；

(4)适配体发卡触发超分支滚环扩增：步骤(3)混合孵育后的适配体发卡与细胞外囊泡混合液中加入环状模板、第二引物和相关扩增试剂，组成超分支滚环扩增体系，混合孵育一段时间后，终止反应，获得超分支滚环扩增产物；

(5)超分支滚环扩增产物的验证：分别利用凝胶电泳成像和酶标仪验证超分支滚环扩增产物，凝胶电泳检测有明亮条带且酶标仪检测具有较高荧光值的为目的细胞外囊泡。

进一步地，步骤(3)中，适配体发卡存在能够特异性识别目标细胞外囊泡表面蛋白的序列，在适配体发卡与细胞外囊泡孵育后，适配体发卡和目标细胞外囊泡表面蛋白序列结合，适配体发卡结构打开。