[发明专利]一种修复损伤组织的干细胞因子脂质体及其制备方法

权利要求书

1.一种修复损伤组织的干细胞因子脂质体的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：

步骤1、分离并培养犬脂肪源间充质干细胞；

步骤2、将培养的犬脂肪间充质干细胞消化后破碎，并通过离心、过滤和超滤获得干细胞提取液；

步骤3、将预先制备的脂质体与干细胞提取液混合，进行超声处理，得到干细胞因子脂质体混悬液，加入丙酸钠混匀后进行过滤，得到干细胞因子脂质体溶液。

2.根据权利要求1所述的修复损伤组织的干细胞因子脂质体的制备方法，其特征在于，所述步骤1中分离犬脂肪源间充质干细胞的具体步骤包括：

从青年犬获得新鲜的肠系膜脂肪，加入2％双抗DPBS缓冲液浸泡清洗，剔除脂肪组织中的血管和筋膜并剪成小块，加入胰蛋白酶消化液，震荡消化后3000r/min离心去除上清液及漂浮脂肪，然后用室温DPBS混匀清洗沉淀层细胞，再次3000r/min离心去除上清液，用含10％FBS、100U/ml青霉素和100U/ml链霉素的MEM培养液重悬沉淀细胞。

3.根据权利要求2所述的修复损伤组织的干细胞因子脂质体溶液的制备方法，其特征在于，对分离出的犬脂肪源间充质干细胞进行活力检测，其活细胞占比需≥95％。

4.根据权利要求2所述的修复损伤组织的干细胞因子脂质体溶液的制备方法，其特征在于，以10％FBS、100U/ml青霉素、100U/ml链霉素的MEM培养液增殖传代，培养足量犬脂肪源间充质干细胞。

5.根据权利要求1所述的修复损伤组织的干细胞因子脂质体溶液的制备方法，其特征在于，所述步骤2具体包括：

将犬脂肪源间充质干细胞用胰蛋白酶消化，3000r/min离心收集干细胞，用室温DPBS混匀清洗沉淀层细胞，再次3000r/min离心去除上清液，将分离得到细胞重悬于无菌生理盐水中，冰浴超声破碎细胞后，12000r/min，4℃离心，取上清弃沉淀，然后将上清先以0.22μm滤膜过滤除菌，再以5k超滤膜过滤浓缩，以生理盐水调节蛋白浓度，0.22μm滤膜过滤后4℃保存。

6.根据权利要求5所述的修复损伤组织的干细胞因子脂质体溶液的制备方法，其特征在于，冰浴超声破碎细胞的条件为：超声强度40％超声3秒，间隔5秒，共超声8次。

7.根据权利要求1所述的修复损伤组织的干细胞因子脂质体溶液的制备方法，其特征在于，脂质体制备方法具体包括：

称取0.4g大豆磷脂，0.05g胆固醇和0.1g吐温80溶于10mL无水乙醇中，超声使其充分溶解，在40-60℃水浴摇床的振荡下，将大豆磷脂，胆固醇和吐温80的混合物导入10mL 10％硫酸铵溶液中，进进行60℃减压蒸发有机溶剂后，置于PH7.0的DPBS中透析24h形成脂质体。

8.根据权利要求1所述的修复损伤组织的干细胞因子脂质体溶液的制备方法，其特征在于，所述步骤3的制备干细胞因子脂质体的具体包括：

将制得的干细胞提取液缓慢加入预先制备的

在40-60℃水浴摇床振荡下，向预先制备的脂质体中缓慢加入20mL步骤(4)中的干细胞提取液，保持40-60℃继续振荡30min；随后置于超声细胞粉碎机进行冰浴低温超声处理，使干细胞因子充分均匀地融合到脂质体中，从而得到干细胞因子脂质体混悬液；，按质量比加入0.5％-1％的丙酸钠充分混匀，再将其分别依次挤压过孔径为0.45μm、0.22μm的微孔滤膜，即得干细胞因子脂质体溶液。

9.一种修复损伤组织的干细胞因子脂质体，其特征在于，采用如权利要求1-8任一项所述方法制备得到。

10.权利要求9所述的修复损伤组织的干细胞因子脂质体，其特征在于，所述干细胞因子脂质体包括脂质体以及包封于脂质体内的干细胞因子，所述干细胞因子为白介素、干细胞生长因子、血管内皮细胞生长因子、成纤维细胞生长因子、基质细胞衍生因子、胎盘生长因子、胰岛素生长因子、存活素或粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子中的一种或几种。