[发明专利]一种用于靶向治疗实体瘤的嵌合抗原受体T淋巴细胞

说明书

本发明提供一种用于靶向治疗实体瘤的嵌合抗原受体T淋巴细胞，是使用氨基酸序列为SEQ ID NO:1的嵌合抗原修改制备的。本发明通过筛选，最终获得一个全新的、靶向实体瘤靶点Claudin18.2的嵌合抗原受体序列。该嵌合抗原插入pLVX‑IRES‑Neo慢病毒表达载体中，使用P3代293T细胞包装慢病毒；有效扩增的T细胞铺板48h后，加入慢病毒感染，获得修饰性的T细胞。利用流式细胞术，检测嵌合抗原受体的表达效率；并将构建成功的修饰性T细胞与Claudin18.2阳性表达的胰腺癌肿瘤细胞共培养，修饰的T细胞对PANC‑1细胞具有显著的杀伤效果。结果表明：构建的靶向实体瘤的CAR‑T细胞，可用于治疗Claudin18.2阳性表达的胰腺癌，胃癌和食管癌等恶性肿瘤。

技术领域

本发明属于生物技术领域，具体涉及一种用于靶向治疗实体瘤的嵌合抗原受体T淋巴细胞。

背景技术

嵌合抗原受体T细胞免疫疗法(CAR-T，全称是Chimeric Antigen Receptor T-Cell Immunotherapy)，是一种有效杀伤恶性肿瘤的免疫疗法。该疗法近几年取得重大进展，现已在白血病和非霍奇金淋巴瘤的治疗取得显著疗效，被认为是最有前景的肿瘤治疗方式之一。

目前，CAR-T技术已发展到第四代。CAR-T疗法中的CAR分子由胞外抗原结合区、跨膜区和胞内区组成。胞外抗原结合区由信号肽和识别靶抗原的单链抗体(scFV)片段组成。胞内区由共刺激分子和信号传导区组成。第四代CAR分子加入了调控开关。据统计，目前临床上最常用的仍为第二代CAR分子。

Claudin 18.2在正常细胞中表达高度受限，但在多种实体瘤(胰腺癌、胃癌和食管癌等)中呈现过表达。Claudin蛋白结构中包括四个跨膜区、两个细胞外环，两个细胞外环使其成为理想的抗体靶点。当前，一些Claudin 18.2单克隆抗体药物也获得了临床试验批件。因此，开发针对靶向Claudin 18.2的CAR-T疗法，将为实体瘤的患者提供新的治疗手段。

实体瘤是一种实质性肿瘤，因其内富含血管和免疫抑制细胞，CAR-T只有进入实体瘤微环境中才能发挥抗肿瘤功能。为了协助CAR-T分子克服肿瘤微环境这一屏障，因此很有必要开发出新的研究方法和工艺，从而给实体瘤的临床治疗带来益处。

发明内容

本发明的目的是一种用于靶向治疗实体瘤的嵌合抗原受体T淋巴细胞，从而提高CAR-T的在实体瘤上的治疗效果，以弥补现有技术之不足。

本发明首先提供一种靶向Claudin18.2分子的嵌合抗原，其氨基酸序列为SEQ IDNO:1。

编码上述嵌合抗原的核苷酸片段，其一种序列为SEQ ID NO:2。

本发明所提供的嵌合抗原用于制备慢病毒来修饰T淋巴细胞；

本发明另一个方面是提供一种使用上述嵌合抗原修饰的T淋巴细胞；

本发明所提供的嵌合抗原修饰的T淋巴细胞在制备用于治疗恶性肿瘤的制品中的应用；

所述的恶性肿瘤，为表达Claudin18.2的胰腺癌，胃癌和食管癌。

本发明通过筛选，最终获得一个全新的、靶向实体瘤靶点Claudin18.2的嵌合抗原受体序列。该嵌合抗原插入pLVX-IRES-Neo慢病毒表达载体中，使用P3代293T细胞包装慢病毒；有效扩增的T细胞铺板48h后，加入慢病毒感染，获得修饰性的T细胞。利用流式细胞术，检测嵌合抗原受体的表达效率；并将构建成功的修饰性T细胞与Claudin18.2阳性表达的胰腺癌肿瘤细胞(PANC-1)共培养，修饰的T细胞对PANC-1细胞具有显著的杀伤效果。结果表明：构建的靶向实体瘤的CAR-T细胞，可用于治疗Claudin18.2阳性表达的胰腺癌，胃癌和食管癌等恶性肿瘤。

附图说明

图1为实施例3中PLV-CARClaudin18.2重组表达载体示意图。