[发明专利]一种水凝胶、制备方法及其三维细胞培养方法

权利要求书

1.一种用于三维细胞培养的水凝胶的制备方法，其特征在于，所述制备方法包括：

步骤S1、制备猪脱细胞真皮和/或猪脱细胞膀胱；

步骤S2、冻干所述猪脱细胞真皮和/或所述猪脱细胞膀胱；

步骤S3、研磨冻干的所述猪脱细胞真皮和/或冻干所述猪脱细胞膀胱成细颗粒；

步骤S4、将所述细颗粒加入胃蛋白酶消化液中，搅拌48h-72h，形成细胞外基质支架；以及

步骤S5、调节所述胃蛋白酶消化液的PH值和盐浓度，使得所述胃蛋白酶灭活，所述细胞外基质支架中的蛋白质进行重组形成所述水凝胶。

2.根据权利要求1所述用于三维细胞培养的水凝胶的制备方法，其特征在于，所述步骤S1中还包括：步骤S11：猪脱细胞真皮原材料处理，其包括：

收集来自市场重量的成年猪的全厚皮肤切片；以及

将全厚皮肤切片切成35cm×50cm的矩形切块，将矩形切块的皮肤皮下脂肪和结缔组织层与猪真皮层分离。

3.根据权利要求2所述用于三维细胞培养的水凝胶的制备方法，其特征在于，将所述猪真皮层在脱细胞处理前可储存至-80℃的冷冻室中，并在脱细胞处理前取出解冻至室温。

4.根据权利要求2所述用于三维细胞培养的水凝胶的制备方法，其特征在于，从成年猪的背部外侧侧面收集全厚皮肤切片。

5.根据权利要求2所述用于三维细胞培养的水凝胶的制备方法，其特征在于，所述步骤S1中还包括：步骤S12：对所述猪真皮层进行脱细胞处理制得所述猪脱细胞真皮，包括：

步骤S121：将所述猪真皮层放入含有0.25％胰蛋白酶溶液的锥形瓶中，在300转/分的轨道摇床上搅拌所述猪真皮层6小时；

步骤S122：移除0.25％胰蛋白酶溶液，将酶解处理后的猪真皮层依次置于含有重蒸水的锥形瓶中，在300转/分的轨道摇床上洗涤三次，每次洗涤时间15分钟；含有70％乙醇溶液的锥形瓶中，在300转/分的轨道摇床上搅拌10小时；含有3％双氧水溶液的锥形瓶中，在300转/分的轨道摇床上搅拌15分钟；含有重蒸水的锥形瓶中,在300转/分的轨道摇床上浸泡两次，每次浸泡时间为15分钟；

步骤S123：将步骤122处理后的猪真皮层置于含有Triton X-100溶液的锥形瓶中，在300转/分的轨道摇床搅拌16小时；移除锥形瓶中已经使用过的Triton X-100溶液，注入新鲜的Triton X-100溶液，在300转/分的轨道摇床上继续搅拌16小时；

步骤S124：将步骤S123处理后的猪真皮层置于含有重蒸水的锥形瓶中，在300转/分的轨道摇床上洗涤三次，每次15分钟；

步骤S125：将步骤S124处理后的猪真皮层放置于含有过氧乙酸溶液的锥形瓶中，在300转/分的轨道摇床上摇晃2小时，制得猪脱细胞真皮；

步骤S126：将所述猪脱细胞真皮依次置于含有1X磷酸盐缓冲盐溶液的锥形瓶中，在300转/分的轨道摇床上洗涤两次，每次15分钟；含有重蒸水的锥形瓶中，在300转/分的轨道摇床上洗涤猪脱细胞真皮15分钟；

步骤S127：将步骤S126处理后的猪脱细胞真皮储存在-80℃的冷冻室中，使用前，取出解冻至室温。

6.根据权利要求5所述用于三维细胞培养的水凝胶的制备方法，其特征在于，使用的所述0.25％胰蛋白酶溶液的体积为所述猪真皮层重量的20倍。

7.根据权利要求5所述用于三维细胞培养的水凝胶的制备方法，其特征在于，所述Triton X-100溶液为浓度1％Triton X-100和浓度0.26％EDTA溶液和0.69％Tris缓冲盐溶液混合形成。