[发明专利]一株布鲁氏菌S2疫苗株DnaA基因条件性诱导缺失菌株、其构建方法及应用

说明书

本发明公开了一株布鲁氏菌S2疫苗株DnaA条件性诱导缺失菌株，该菌株为在条件性诱导外源DnaA表达的基础上缺失内源性DnaA基因的布鲁氏菌S2疫苗株，可用于制备布鲁氏菌减毒疫苗。布鲁氏菌S2疫苗株DnaA条件性诱导缺失菌株为探究DnaA对布鲁氏菌的致病机制及区分自然感染和人工免疫的特性奠定基础，对预防和控制布病具有重要的意义。

技术领域

本发明涉及生物领域，具体涉及一株布鲁氏菌S2疫苗株DnaA条件性诱导缺失菌株、其构建方法及应用。

背景技术

布鲁氏菌病是一种威胁人类健康的人畜共患病，其病原体是布鲁氏菌，属于革兰氏阳性菌。其宿主多种多样，以猪，牛，山羊，绵羊等为主的家畜，同时还有海豚在内的海洋动物以及一些其他的野生动物，并且还可以感染给人类，布鲁氏菌可引起怀孕母畜流产，不孕，以及公畜睾丸炎。目前，动物上常用的疫苗，包括流产布鲁氏菌S19和波浪热布鲁氏菌Rev.1，在使用上存在血清诊断干扰和残留毒力等缺点。人类感染布鲁氏菌后的主要特征是在感染的慢性阶段反复发热，以及关节疼痛，骨骼肌肉衰弱，严重时可导致人类劳动能力丧失，引起社会负担加重。据统计，全球每年有50多万人感染布鲁氏菌病。既不能通过抗生素治疗康复，也没有疫苗可以安全有效的预防人布鲁氏菌病。

布鲁氏菌的细胞周期，包括单极生长和染色体的有序启动复制，布鲁氏菌细胞周期始于细胞不对称分裂，并产生两个不同的子细胞。子细胞经历一个染色体复制尚未开始的时期，称为间隙期1(G1).而在DNA合成阶段，细菌染色体复制已经开始了。染色体复制结束与细胞分裂之间的阶段为G2.当布鲁氏菌被宿主细胞摄取时，细菌首先在G1期被阻断，细菌的生长和染色体复制在到达细胞内增殖室前不久才重新开始。由于细菌的DNA复制起始受到严格的时间和空间调控，因此，在进入宿主细胞内，细菌的细胞周期只发现一次。在α-变形杆菌纲中，DivK CtrA调控网络被保存下来控制细菌细胞周期。DnaA蛋白包含DNA结合域和ATP/ADP结合域，是与染色体起源结合并开始染色体复制的启动子。当ATP-DnaA在细胞内积累，染色体才开始复制。然而，一旦在细胞中开始复制，ATP-DnaA通过DNA-loading b-clamp/HdaA(与DnaA同源)复合物迅速转化为DnaA-ADP.同时研究表明，细菌的细胞周期与细菌的毒性相协调。DnaA通过RNA-seq参与细菌细胞周期的调控，抑制DnaA表达会引起布鲁氏菌的衰减，在小鼠模型中具有较高的免疫原性。总之，这些研究表明，DnaA参与了布鲁氏菌的体内外毒力，在布鲁氏菌的胞内复制生长过程中发挥重要的作用。

到目前为止，仍没有一种兽用的疫苗可以安全有效的适用于市场，且对人类具有致病性。布鲁氏菌DnaA蛋白作为启动子在细菌细胞周期调控网络中发挥重要作用，但仍未被成功的缺失，其重要原因是由于DnaA是染色体复制的启动子。其对布鲁氏菌的细胞周期具有重要的调控作用。

发明内容

本发明的目的在于提供了一株布鲁氏菌S2疫苗株DnaA条件性诱导缺失菌株、其构建方法及应用。

为实现上述目的，本发明采取的技术方案为：

一株布鲁氏菌S2疫苗株DnaA条件性诱导缺失菌株，该菌株为猪种布鲁氏菌S2DnaA△DnaA，于2019年12月2日保藏在中国典型培养物保藏中心，其保藏号为CCTCC NO：M2019992。

所述菌株为在条件性诱导外源DnaA表达的基础上缺失内源性DnaA基因的布鲁氏菌S2疫苗株，通过以下方法构建：

S1、利用Primier Primier 5设计DnaA基因上下游引物及扩增引物、骨架载体扩增引物、四环素诱导启动子扩增引物、卡那霉素抗性基因和筛选缺失DnaA基因鉴定引物，引物序列如下：

骨架载体引物：

F：5’-TTGACATAAGCCTGTTCGGTTCGTA-3’

R：(5’-CCTCCCAGAGCCTGATAAAAACG-3’)