[发明专利]一株布鲁氏菌S2疫苗株Omp16基因条件性诱导缺失菌株、其构建方法及应用

说明书

本发明公开了一株布鲁氏菌S2疫苗株Omp16基因条件性诱导缺失菌株，该菌株为猪种布鲁氏菌S2 Omp16ΔOmp16，于2019年12月2日保藏在中国典型培养物保藏中心，其保藏号为CCTCC NO：M2019991。所述菌株为在条件性诱导外源Omp16表达的基础上缺失内源性Omp16基因的布鲁氏菌S2疫苗株，可用于制备布鲁氏菌减毒疫苗。布鲁氏菌S2疫苗株Omp16基因条件性诱导缺失菌株为探究Omp16对布鲁氏菌的致病机制及区分自然感染和人工免疫的特性奠定基础，对预防和控制布病具有重要的意义。

技术领域

本发明涉及生物领域，具体涉及一株布鲁氏菌S2疫苗株Omp16基因条件 性诱导缺失菌株、其构建方法及应用。

背景技术

布鲁氏菌又称布鲁菌或布氏杆菌，属于革兰阴性胞内寄生菌，能够引起布 鲁氏菌病，简称布病。布鲁氏菌主要感染反刍动物，如牛、羊和猪，但仍然可 以感染野生动物和海洋动物，乃至人类。布鲁氏菌感染家畜主要症状为怀孕母 畜的妊娠后期流产和公畜的睾丸炎。人类感染布鲁氏菌的主要症状与家畜不同， 临床上主要表现为反复发热、无力、关节炎和睾丸炎等。布鲁氏菌在全球的不 断肆虐，造成严重的经济损失。每年，全球约超过50万人感染布鲁氏菌病。 此外，由于人类缺乏典型的临床症状，真实的每年新感染人数可能更高。人类 感染布鲁氏菌病主要通过直接接触患病动物或食用受污染的奶制品，并且人类 感染布鲁氏菌具有职业倾向性，如牧民和兽医为高风险感染人群。

布鲁氏菌外膜蛋白具有重要的免疫炎性和保护原性，并且也有相关试验表 明布鲁氏菌外膜蛋白与其毒力密切相关。Omp22，Omp25和Omp31作为布鲁氏 菌重要的细胞壁成分和主要毒力因子有利于布鲁氏菌的胞内生存和慢性感染 的建立，并且其突变株在自然宿主中有具有减毒的效应。相关试验揭示布鲁氏 菌Omp25通过调控不同MicroRNAs的调控抑制TNF-a的分泌。但是，布鲁氏 菌Omp10、Omp19、SP41和BepC的外膜蛋白突变体并不影响布鲁氏菌在巨噬细 胞中的毒力。布鲁氏菌Omp16是肽聚糖相关脂蛋白的同源物，作为布鲁氏菌的 病原体相关分子模式能够活化树突状细胞及介导Th1免疫反应。此外，布鲁氏 菌Omp16具有高度保守性，表明其在布鲁氏菌的胞内生存和持续性感染过程中 发挥重要的作用。

目前为止，兽用布鲁氏菌疫苗仍然存在许多缺陷，如干扰诊断测试、对人 类具有致病性，引起怀孕动物的流产等等，并且人类没有可用的布鲁氏菌疫苗。 布鲁氏菌Omp16基因作为重要的毒力因子，仍然未被成功缺失，对于研究Omp16 的功能具有一定的局限性。布鲁氏菌Omp16不能被成功缺失可能是由于其是布 鲁氏菌生存的必须基因，对于布鲁氏菌的生长和感染的建立至关重要。

发明内容

本发明的目的在于提供了一株布鲁氏菌S2疫苗株Omp16基因条件性诱导 缺失菌株、其构建方法及应用。

为实现上述目的，本发明采取的技术方案为：

一株布鲁氏菌S2疫苗株Omp16基因条件性诱导缺失菌株，该菌株为猪种 布鲁氏菌(Brucella suis bv.1.str.)S2 Omp16△Omp16，于2019年12 月2日保藏在中国典型培养物保藏中心,地址：中国，武汉，武汉大学；其保 藏号为CCTCC NO：M2019991。

所述菌株为敲除Omp16基因的布鲁氏菌S2疫苗株，通过如下步骤构建：

S1、引物设计

利用Primier Primier 5设计Omp16基因扩增引物、Omp16上下游扩增引 物、骨架载体扩增引物、四环素诱导启动子扩增引物、氨苄霉素抗性基因扩增 引物、筛选缺失Omp16基因鉴定引物和定量引物，引物序列如下：

pBBR1 MCS5骨架载体扩增引物：

F1(5’-TTGACATAAGCCTGTTCGGTTCGTA-3’)

R1(5’-CCTCCCAGAGCCTGATAAAAACG-3’)