[发明专利]一种高效生产转谷氨酰胺酶的方法及其专用工程菌

说明书

本发明公开了一种高效生产转谷氨酰胺酶的方法及其专用工程菌。本发明提供了一种蛋白质，为序列表的序列2所示的蛋白质。本发明还保护将表达所述蛋白质的DNA分子导入谷氨酸棒状杆菌得到的重组微生物。所述重组微生物可用于制备转谷氨酰胺酶。本发明将来源于茂源链霉菌的MTG在T7启动子下进行表达，并在MTG的pro区与成熟区之间插入内含肽ssp‑dnaB成功实现了MTG在谷氨酸棒杆菌中的高效表达，发酵所得菌体经超声破碎后，无需蛋白酶处理或者其他条件改变，即可得到具有生物活性的MTG。本发明可用于制备转谷氨酰胺酶，进而应用于组织工程、纺织品和皮革加工等领域，具有应用推广价值。

技术领域

本发明属于生物技术领域，具体涉及一种高效生产转谷氨酰胺酶的方法及其专用工程菌。

背景技术

转谷氨酰胺酶(Transglutaminase，EC 2.3.2.13，TGase)属于转移酶家族，可催化从谷氨酰胺残基的γ-羧酰胺基团(供体)到各种伯胺(酰基受体)的酰基转移。目前，TGase在食品加工领域中使用已经超过10年，并且被美国食品药品管理局(FDA)公认安全(GRAS)。TGase能够通过蛋白质分子内、分子间的交联作用改善蛋白质的性质。因此，该酶在组织工程、纺织品和皮革加工等领域中显示出更广泛的应用价值。

TGase在动物和植物中广泛存在，但其产量低，且分离纯化成本高，远远不能满足人们的需求。1989年，微生物来源的TGase(Microbial TGase，MTG)被首次发现，与其它来源TGase相比，MTG具有非Ca²⁺依赖性、温度高和pH稳定性高等特点。此外，微生物法生产MTG具有生产周期短、产量高、成本低、易于工业化生产等优势。因此，人们更倾向于使用微生物法来大规模生产MTG。

MTG通常以无活性的酶原形式(pro-MTG)分泌到胞外，经蛋白酶水解切除掉酶原区(pro区)，才能形成有活性的成熟MTG。pro区的存在对MTG形成正确的空间结构及分泌具有重要的作用。

内含肽是一种能够通过氨基酸之间亲核取代且无需其他辅因子参与即可实现蛋白质剪接的蛋白质。由于其独特的作用机制，目前已在生物技术、生物医学和蛋白质化学中广泛使用。dnaB是一种来源于集胞藻属(Synechocystis sp)编码的DNA解旋酶基因，经过优化改造之后，其C-端的106个氨基酸及N-端48个氨基酸组成了内含肽的最小作用单元。优化后的内含肽ssp-dnaB的C-端剪切是依赖于pH的。

目前越来越多的表达系统被用来表达MTG，但是还是存在表达量低，后期需蛋白酶二次处理等问题。也有一些研究利用内含肽在大肠杆菌、枯草芽孢杆菌中成功实现了MTG的表达，但是仍需经过pH或者温度变化的二次处理来实现pro区的剪切，极大的增加了工业生产成本及时间成本。

发明内容

本发明的目的是提供一种高效生产转谷氨酰胺酶的方法及其专用工程菌。

本发明提供了一种蛋白质(蛋白质甲)，为如下(a1)或(a2)：

(a1)序列表的序列2第1-532位氨基酸残基所示的蛋白质；

(a2)序列表的序列2所示的蛋白质。

编码所述蛋白质甲的核酸分子也属于本发明的保护范围。

编码所述蛋白质甲的DNA分子也属于本发明的保护范围。

所述DNA分子具体为如下(b1)至(b6)中的任一：

(b1)编码区如序列表的序列1第6389-7981位核苷酸所示的DNA分子；

(b2)编码区如序列表的序列1第6386-7981位核苷酸所示的DNA分子；

(b3)编码区如序列表的序列1第6389-7999位核苷酸所示的DNA分子；