[发明专利]一种用于微生物培养的新型荧光原位杂交检测方法

权利要求书

1.一种用于微生物培养的新型荧光原位杂交检测方法，其特征在于，包括以下步骤：

S1、取含有微生物的载体5-7ml放置在试管中，之后再12000*g中离心5-10min，去除上清液，其沉淀采用1*PBS溶液清洗，再以12000*g中离心5-10min，后悬于0.2ml 1*PBS溶液中，之后加入的含有4％多聚甲醛的1*PBS溶液，在4-6℃下保存，并且不超过12-16h；

S2、取上述制备保存的试样放置在12000*g中离心5-10min，去除固定剂，之后重悬于1*PBS溶液中清洗，之后将固定细胞完全悬于200μL PBS中，并加入等体积的无水乙醇，在零下18-20℃下保存；

S3、取10μL适当浓度稀释的细胞，放入载玻片的中央，自然风干，再分别用不同梯次的乙醇进行梯次脱水，风干；

S4、取出载玻片，用质量分数为1％的盐酸浸泡24h，再在质量分数为1％的重铬酸钾洗液中浸泡24h，将玻片和盖玻片在质量分数为1％的盐酸中煮沸7-10min，烘干，将烘干后的玻片放入明胶中浸泡15-20min，之后再35-40℃下烘干备用；

S5、将S4中制备好的载玻片加入铺有湿润是指的盒中杂交，探针和杂交液按比例混合；

S6、杂交温度为40-45℃，杂交2h，从杂交盒中取出载玻片放入45-48℃利用杂交洗脱液洗脱20min，再用相同温度的去离子水进行洗脱20min，洗去没有杂交的和非特异性杂交的探针；

S7、利用DAPI对所有微生物DNA进行染色，并在此后洗脱，风干后，滴加防淬灭剂，盖上盖玻片，封固，观察。

2.根据权利要求1所述的一种用于微生物培养的新型荧光原位杂交检测方法，其特征在于：所述S1中加入三倍体积的含有4％多聚甲醛的1*PBS溶液。

3.根据权利要求1所述的一种用于微生物培养的新型荧光原位杂交检测方法，其特征在于：所述S3中的梯次脱水依次采用50％乙醇/PBS,80乙醇/PBS,100％乙醇各脱水3min。

4.根据权利要求1所述的一种用于微生物培养的新型荧光原位杂交检测方法，其特征在于：所述S5中探针采用探针S-*-Amx-0368-a-A-18和S-*-Amx-0820-a-A-22配制成25mg/L的探针溶液，每管分装75μL。

5.根据权利要求4所述的一种用于微生物培养的新型荧光原位杂交检测方法，其特征在于：所述S5中的探针和杂交液按1:8.5的比例混合。

6.根据权利要求4所述的一种用于微生物培养的新型荧光原位杂交检测方法，其特征在于：所述洗脱液采用5M Nacl，20mM Tris-Hcl，0.01％SDS混合配制而成。