[发明专利]一种牛布病A19-ΔVirB12疫苗的血清学检测方法在审
| 申请号： | 202010286353.8 | 申请日： | 2020-04-13 |
| 公开（公告）号： | CN111398604A | 公开（公告）日： | 2020-07-10 |
| 发明（设计）人： | 易新萍;叶锋;马晓菁;钟旗;刘丽娅;谷文喜;谢彩云;张旭;薛晶;李静;古努尔·吐尔逊;李岩 | 申请（专利权）人： | 新疆畜牧科学院兽医研究所（新疆畜牧科学院动物临床医学研究中心） |
| 主分类号： | G01N33/68 | 分类号： | G01N33/68;G01N33/58;G01N33/569;G01N33/543;C12N15/70;C12N15/31;C07K14/23;C07K1/16;C12N15/11 |
| 代理公司： | 北京众合诚成知识产权代理有限公司 11246 | 代理人： | 刘妮 |
| 地址： | 830011 新疆维吾尔*** | 国省代码： | 新疆;65 |
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| 摘要： | |||
| 搜索关键词： | 种牛 a19 virb12 疫苗 血清学 检测 方法 | ||
1.一种牛布病A19-ΔVirB12疫苗的血清学检测方法，其特征在于，包括以下步骤：
1)以布鲁氏菌VirB12蛋白作抗原包被酶标板，VirB12蛋白作为抗原的包被量为50ng/mL；
2)以布病标准阳性牛血清为阳性对照；以1×PBS缓冲液为空白对照；确诊为布病阳性牛血清为待检样品；以辣根过氧化物酶标记的兔抗牛IgG为二抗；
3)以ELISA方法的操作步骤进行样品检测并进行结果判定。
2.根据权利要求1所述的一种牛布病A19-ΔVirB12疫苗的血清学检测方法，其特征在于，判定方法为：布病标准阳性血清的检测值OD450nm≥0.60，空白对照OD450nm≦0.10时，则视为该检测试验数据有效；设定待检血清OD450nm值为N，国际布病标准阳性血清的检测值OD450nm为P，N/P≥60％判定为布病阳性自然感染动物；否则判定为免疫动物。
3.根据权利要求1所述的一种牛布病A19-ΔVirB12疫苗的血清学检测方法，其特征在于，所述的布鲁氏菌VirB12蛋白通过以下方法制备：
1)根据布鲁氏菌A19的VirB12基因设计引物，如SEQ ID NO.3～4所示；
2)从牛种布鲁氏菌A19株提取细菌总DNA，以细菌总DNA为模板，进行聚合酶链反应，获得VirB12蛋白基因；
3)将VirB12蛋白基因转入原核表达载体pET-28a(+)中，获得重组表达载体；
4)将重组表达载体导入大肠杆菌感受态细胞BL21(DE3)中诱导表达，收集菌体VirB12抗原蛋白；
5)收集的VirB12抗原蛋白经8M尿素变性，组氨酸结合树脂柱纯化，复性得到纯化的VirB12蛋白。
4.根据权利要求3所述的一种牛布病A19-ΔVirB12疫苗的血清学检测方法，其特征在于，所述纯化的VirB12蛋白经Western-blot鉴定具有免疫活性，能被感染布鲁氏菌阳性牛血清所识别。
5.根据权利要求1所述的一种牛布病A19-ΔVirB12疫苗的血清学检测方法，其特征在于，所述的VirB12蛋白的氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示。
6.一种用于扩增VirB12蛋白的引物，其特征在于，所述的引物如SEQ ID NO.3～4所示。
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