[发明专利]一种检测β-鹅膏毒肽的酶联免疫试剂盒及其制备和应用

说明书

本发明公开了一种检测β‑鹅膏毒肽的酶联免疫试剂盒、试剂盒的制备以及应用，本发明所提供的试剂盒由酶标板（包被式Iβ‑鹅膏毒肽药物半抗原与载体蛋白的偶联物）、抗体工作液（含β‑鹅膏毒肽药物单克隆抗体）、酶标记物工作液（含辣根过氧化物酶标记的抗β‑鹅膏毒肽药物单克隆抗体的抗抗体）、洗涤液、样品稀释液、样品提取液、含不同梯度浓度β‑鹅膏毒肽标准品溶液、底物显色液、终止液组成。本发明所提供的β‑鹅膏毒肽检测试剂盒可用于贝类食品中β‑鹅膏毒肽的检测，在血清、尿液中β‑鹅膏毒肽检测限可定为10µg/L，批间变异系数小于10%、批内变异系数小于15%，具有操作简单、快速，灵敏度高、特异性强、准确性强的优点，对于食物中毒的快速检测具有重大价值。

技术领域

本发明属于药物残留快速检测领域，涉及一种检测β-鹅膏毒肽的试剂盒及其制备方法与应用。

背景技术

蘑菇食物中毒一直以来是世界上许多国家重点关注的食品安全问题之一，多年来蘑菇中毒也一直是我国食物中毒事故导致死亡的主要原因。鹅膏毒肽（amatoxins，AMA）是鹅膏菌属类蘑菇中的一种有毒环肽，是引起致死性食物中毒的主要毒素，β-鹅膏毒肽（β-AMA）是鹅膏毒肽中含量最高、毒性最强的一种。β-鹅膏毒肽引起的食物中毒易误诊且缺乏针对性治疗，因此早期诊断对于鹅膏毒肽中毒的救治尤为重要。

目前血浆和尿液等生物样品中鹅膏肽类毒素的检测方法主要有毛细管电泳法、放射免疫法、高效液相色谱及质谱法等，其中液相色谱-串联质谱法能实现毒素的高通量精确分析而成为目前最主要的方法。已有的方法存在检测通量低、假阳性、灵敏度低和基质效应严重等问题，特异性强、灵敏度高的方法操作繁琐、仪器昂贵，不适用于大批量样品的筛选检测，不能满足现场检测需求。

发明内容

本发明的目的在于提供一种检测β-鹅膏毒肽的酶联免疫试剂盒，并提供一种灵敏度高、特异性强、检测成本低、适于大批量样品筛选的检测方法。

为了实现上述目的，本发明的技术方案如下：

一种检测β-鹅膏毒肽的酶联免疫试剂盒，由酶标板、标准品工作液、抗体工作液、酶标记物工作液、样品稀释液、样品提取液、洗涤液、底物显色液、终止液组成。

所述酶标板由β-鹅膏毒肽药物半抗原与载体蛋白的偶联物包被制成。

所述β-鹅膏毒肽半抗原是mL。

所述β-鹅膏毒肽半抗原由如下方法制备而成：称取β-鹅膏毒肽原料10mg，10mL 二甲基甲酰胺（DMF）溶解，加入6.25mg 1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐（EDC），3.75mg N-羟基琥珀酰亚胺（NHS）室温反应3h，加入1.42mg 6-氨基己酸，室温反应过夜，TLC反应完全，薄层制备板纯化得半抗原（式I）。

式I

所述载体蛋白为牛血清白蛋白（BSA）、人血清白蛋白（HSA）、鼠血清蛋白（MSA）、甲状腺蛋白（BCG）、兔血清蛋白（RSA）、血蓝蛋白（KLH）或卵清白蛋白（OVA）。

所述β-鹅膏毒肽半抗原与载体蛋白的偶联物是指β-鹅膏毒肽半抗原与载体蛋白通过活性酯法得到的产物，具体包括如下步骤：

1）将所述β-鹅膏毒肽半抗原（式I）溶解于DMF中，然后加入EDC和NHS，20-25℃磁力搅拌反应2-3h，得到溶液I；

其中，所述β-鹅膏毒肽半抗原（式I）、所述DMF、所述EDC、所述NHS的配比为2.29mg：0.5mL：1 mg：1 mg；

2）将所述载体蛋白置于0.1 M碳酸氢钠缓冲液中，200 rpm搅拌10 min，充分溶解，得到溶液II；所述载体蛋白与所述0.1 M碳酸氢钠缓冲液的配比为10 mg：2.0 mL；