[发明专利]一种基于水凝胶复合膜流速测定透明质酸酶浓度的检测方法

说明书

本发明公开了一种基于水凝胶复合膜流速测定透明质酸酶浓度的检测方法，借助透明质酸‑‑聚乙烯亚胺水凝胶‑混合纤维素滤膜构成的复合膜结构，构建了一个用于检测透明质酸酶的流速测定体系。当透明质酸酶存在时，透明质酸酶可以对透明质酸进行酶切反应，酶切后的透明质酸水凝胶滤膜之间的孔隙大小发生相应变化。因此，通过透明质酸水凝胶复合膜的水的流速会发生相应的变化，排出的水的质量也产生相应的变化，基于此实现了对透明质酸酶浓度的检测。本发明方法原料易得、操作简单、耗时较短而且灵敏度高，有望在生命科学及医学临床检测等领域得到广泛应用。

技术领域

本发明涉及分析化学的技术领域，特别是指一种基于水凝胶复合膜流速测定透明质酸酶浓度的检测方法。

背景技术

透明质酸(HA)是一种线性阴离子糖胺聚糖，透明质酸的结构由D-葡萄糖醛酸和N-乙酰基-D-葡萄糖胺形成的重复二糖单元组成。透明质酸的合成和降解与各种生物过程，如胚胎发生，炎症，伤口愈合，细胞增殖，分化和迁移密切相关，并可能参与某些恶性肿瘤的发展。透明质酸酶(HAase)是一种内切葡聚糖酶，可将透明质酸切割成小片段，降解透明质酸调节肿瘤细胞的转移。据报道，透明质酸酶的过表达与许多恶性肿瘤如前列腺癌，膀胱癌，脑癌和结肠直肠癌有关。因此，透明质酸酶作为潜在的肿瘤标志物，对其进行早期检测对癌症的临床诊断和治疗具有重要意义。现阶段，研究人员开发出的主要检测方法有粘度法、酶谱法、比浊法、荧光法、比色法、免疫测定法等。但是这些方法均需要复杂而漫长的前期准备工作或贵重的仪器以及繁琐的操作。因此，发展一种简单快捷的透明质酸酶检测方法是迫切需要的。

发明内容

本发明的目的在于克服现有技术的不足，提供一种操作简单、灵敏度高的基于水凝胶复合膜流速测定透明质酸酶浓度的检测方法。

为了达成上述目的，本发明的解决方案是：

一种基于水凝胶复合膜流速测定透明质酸酶浓度的检测方法，包括以下步骤：

步骤S1：将透明质酸溶液与1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐(EDC)溶液和N-羟基琥珀酰亚胺(NHS)溶液混合15min，反应后所得的溶液加入到可换膜针式过滤器内放置的已被润湿的混合纤维素滤膜表面，将聚乙烯亚胺(PEI)溶液滴加在上述混合溶液上部，震荡均匀，用石蜡封口膜密闭整个装置，3h后形成以混合纤维素微孔滤膜为基膜的透明质酸-聚乙烯亚胺水凝胶复合滤膜；

步骤S2：将不同浓度的透明质酸酶分别加入到装有复合滤膜的可更换滤膜针式过滤器中，进行酶切反应，反应完后在该复合膜上再覆盖一层滤膜，拧上针式过滤器的下半部分，过滤器的上半部分接入一支装有少量水的10毫升注射器，拔掉注射器活塞后加水到10毫升指示线位置，将该过滤装置安装到带有两通阀的隔膜真空泵上，待隔膜泵读数稳定后打开两通阀，收集5分钟内通过水凝胶复合膜的水，用电子天平称量水的质量；

步骤S3：根据收集到的不同透明质酸酶浓度体系的水的质量，绘制标准曲线；

进一步，所述步骤S1具体如下：

步骤S1-1：透明质酸溶液质量分数为1％，用量为40μL，1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐溶液浓度为97.6mg/mL，用量为10μL，N-羟基琥珀酰亚胺(NHS)溶液浓度为23mg/mL，用量为10μL；混合温度为25℃；

步骤S1-2：聚乙烯亚胺溶液质量分数为0.4％，用量为20μL，加入滤膜前先加入60μL超纯水增加聚乙烯亚胺溶液体积；混合温度为25℃。

进一步，所述步骤S2具体如下：

骤S2-1：将不同浓度的透明质酸酶分别加入到装有透明质酸水凝胶复合膜的针式过滤器中，在37℃下进行酶切反应120分钟；

步骤S2-2：将过滤器中的透明质酸酶溶液吸出，用少量超纯水轻轻洗涤滤膜，再将残余液体吸出；