[发明专利]筛选Family B DNA Polymerase抗体封闭聚合酶活性的方法

说明书

本发明公开了一种筛选Family B DNA Polymerase抗体封闭聚合酶活性的方法，包括如下步骤：合成引物S1‑F3和S1‑R2，两引物的3’端部分互补，将引物混合并退火；接着，加入足量dNTPs，在热启动酶的作用下延伸引物，随后通过荧光染料检测反应体系中产物的熔解曲线，由该检测结果确定抗体是否能够封闭聚合酶活性。本发明还公开了一种筛选Family B DNA Polymerase抗体封闭聚合酶活性的试剂盒。本发明的筛选Family B DNA Polymerase抗体封闭聚合酶活性的方法，其无放射性污染，灵敏度高，具有较好的工业应用价值。

技术领域

本发明属于生物工程领域，具体地说，是关于一种筛选Family B DNA Polymerase抗体封闭聚合酶活性的方法。

背景技术

Family B DNA Polymerase是新一代的高保真DNA聚合酶。该酶基于PyrococcusFuriosis DNA Polymerase，经基因工程改造而成。其蛋白结构包含5’→3’聚合酶结构域和经过改造的3’→5’外切酶结构域。这种组合大幅度提升了酶的耐热性，保真性。耐热温度达到98℃，保真性是Taq DNA聚合酶的52倍，普通Pfu DNA聚合酶的6倍。酶溶液中添加了独特的延伸因子，扩增速度达到15sec/kb。本产品配备了优化后的酶缓冲液，添加了PCR增强组分，使得该酶具有极强的扩增效率和广泛的模板适应性，非常适合复杂模板的扩增。扩增产物为平末端，可磷酸化后克隆到平滑末端载体中。该酶可应用于高保真PCR、基因克隆、定点突变、高通量PCR。

该Family B DNA Polymerase抗体与Family B DNA Polymerase具有很高的亲和力，高温50℃处理30min，依旧可以封闭其聚合酶活性，其热启动酶在预变性温度下加热30sec完全失活，释放出DNA聚合酶活性。使用该热启动酶可以有效抑制引物非特异性退火导致的扩增。

但是，在筛选抗体之前，首先要解决的是如何建立筛选Family B DNA Polymerase抗体封闭聚合酶活性的方法。现有的方法，一般地，是通过测定DNA Polymerase的活性来间接确定其抗体的活性。而标准的DNA Polymerase活性测定方法采用放射性底物掺入法，即采用以³H标记的dTTP为底物，经DNA Polymerase将其掺入到活化的大马哈鱼精子DNA上。经过TCA沉淀、whatman滤纸过滤，通过测定酸不溶性产物中放射性同位素的量，计算出DNAPolymerase的活性。这种方法易产生放射性污染，且步骤多、周期长，难以实现高通量、自动化，因此为筛选带来了困难。

发明内容

本发明的的第一个目的是提供一种简便、灵敏、重现性好、非放射性的筛选FamilyB DNA Polymerase抗体封闭聚合酶活性的方法。本发明的第二个目的是提供一种筛选Family B DNA Polymerase抗体封闭聚合酶活性的试剂盒。

为实现上述目的，本发明采用以下技术方案：

作为本发明的第一个方面，一种筛选Family B DNA Polymerase抗体封闭聚合酶活性的方法，包括如下步骤：

步骤一、合成引物S1-F3和S1-R2，将引物混合并退火，其中，所述S1-F3和S1-R2的3’端部分互补；

步骤二、加入足量dNTPs，在热启动酶的作用下延伸引物，在40℃下反应30min；所述热启动酶为Family B DNA Polymerase抗体和Family B DNA Polymerase的复合物；

步骤三、取出，加入可以特异结合双链DNA并发荧光的物质，上机，观察熔解曲线，由该检测结果确定抗体是否能够封闭聚合酶活性。

根据本发明，所述可以特异结合双链DNA并发荧光的物质为SYBR green、evagreen、EB等。