[发明专利]一种CA9肿瘤抗原特异性的细胞毒性T淋巴细胞

说明书

本发明提供了一种肾细胞癌肿瘤抗原CA9特异性细胞毒性T淋巴细胞制备方法，包括以下步骤：将含靶向SOCS1的siRNA和碳酸酐酶9的重组载体感染成熟DC细胞，得到iSOCS1‑CA9‑DC细胞；然后将iSOCS1‑CA9‑DC细胞与T细胞混合培养，获得CA9‑DC‑CTL细胞，即具有抗原特异性的细胞毒性T淋巴细胞。本发明采用复制缺陷型腺病毒介导RNAi下调SOCS1基因表达，联合CA9及S‑Flagellin刺激DC细胞成熟，诱导特异性的CTL抗肾细胞癌。有效的增强了CTL对肾癌细胞的靶向性，避免对自体细胞的损伤，可以有效的抑制肿瘤的生长，延长患者生存期。

技术领域

本发明属于免疫细胞治疗领域，具体涉及一种经携带抑制免疫负调控基因及碳酸酐酶IX基因的腺病毒载体修饰的树突状细胞激活的CA9肿瘤抗原特异性的细胞毒性T淋巴细胞及其培养方法。

背景技术

免疫细胞治疗是治疗癌症的新的一种治疗手段，分离患者外周血的淋巴细胞对多种外来抗原具有很好的反应能力。因此通过体外培养DC细胞、诱导高效的细胞毒性T淋巴细胞（CTL）、回输患者，成为很好的治疗方法。目前常采用肿瘤细胞裂解物加载DC，但其有不足，非肿瘤相关抗原种类多，易诱发自身免疫病，且多抗原带来免疫原性低等缺点。另一种刺激诱导物采用肿瘤抗原肽致敏DC，其特异性好，可多次免疫等优点，但也存在不足：抗原肽一般价格较贵，且半衰期短，需要多次免疫才能获得良好的CTL。

为了克服上述缺点，发展了沉默免疫负调控基因（inhibition of antigen-presentation attenuator, iAPA）技术。沉默免疫负调控基因技术核心是采用腺病毒载体或其他非整合染色体技术介导siRNA特异性阻断抗原呈递细胞中的负调控因子，使其基因表达沉默，能够解除自体免疫耐受，增强抗原特异性免疫防疫。Si-Yi Chen等首先提出了iAPA的概念和设想并进行了系列研究，结果表明，采用RNAi方法沉默DC内细胞因子信号传导抑制因子-1（suppressor of cytokine signaling-1，SOCS1）基因的表达，能够促进DC的成熟，改变其耐受原性；增强DC细胞诱导免疫的免疫强度和时间，同时增强免疫记忆功能，从而打破宿主水平的自身耐受性并超激活抗原特异性的CTL反应，控制弱免疫源性肿瘤的生长；可以更好的促进DC的成熟，进而提高DC的抗原呈递功能； 同时表达分泌游离态Flagellin，能够进一步刺激DC细胞成熟。

碳酸酐酶IX（carbonic anhydrase IX, CAIX或CA9）是分布于细胞膜和细胞核膜的糖蛋白。Oosterwi JK等首先获得鼠源的CA9单抗，利用单抗对多数类型的肾细胞癌进行免疫组化，88%有该抗原表达，而多数组织不表达，只在胃粘膜和大胆管上皮细胞有少量表达。因此，肿瘤相关抗原CA9可以作为肾细胞癌的肿瘤标志物或靶标。

发明内容

针对目前免疫细胞治疗对肾癌细胞的靶向性差的问题，本发明提供一种经携带抑制免疫负调控基因及碳酸酐酶IX基因的腺病毒载体修饰的树突状细胞激活的CA9肿瘤抗原特异性的细胞毒性T淋巴细胞的培养方法。

为实现上述目的，本发明采用如下技术方案。

一种CA9肿瘤抗原特异性的细胞毒性T淋巴细胞的培养方法，包括以下步骤：

（1）将含靶向SOCS1的siRNA、CA9和Flagellin鞭毛蛋白基因的重组载体感染成熟DC细胞，得到iSOCS1-CA9-DC细胞；

（2）将步骤（1）得到的iSOCS1-CA9-DC细胞与T细胞混合培养，获得CA9-DC-CTL细胞，即具有抗原特异性的细胞毒性T淋巴细胞。

步骤（1）中，所述重组载体的目的基因序列依次为U6启动子-SOCS1 siRNA -CMV启动子-CA9基因-IRES序列-Flagellin鞭毛蛋白基因序列。

优选的，所述SOCS1 siRNA的结构为发卡siRNA。