[发明专利]重组载体的构建方法及其构建的重组载体及应用

权利要求书

1.一种重组载体的构建方法，其特征在于，所述构建方法包括下述步骤：

1)pRTL1-LC质粒作为模板用于overlap PCR扩增目的片段做A2798C突变来毁掉SpeⅠ位点，扩增产物通过双酶切后连接到pRTL1-LC的对应位置制得pRTL2载体；

2)pRTL1-LC质粒作为模板用于overlap PCR扩增目的片段做A4132G和A4137C突变来毁掉SalⅠ位点，扩增产物通过双酶切后连接到pRTL2的对应位置制得pRTL3载体；

3)pRTL3载体作为模板用于overlap PCR扩增目的片段做T620A和G626C突变来加入SpeⅠ位点的同时毁掉EcoRⅠ位点，同时在尾端加入BamHⅠ、ClaⅠ和XbaⅠ位点，扩增产物通过双酶切后连接到pRTL3的对应位置制得pRTL4载体；

4)pRTL1-HC质粒作为模板用于overlap PCR扩增目的片段4685bp-1994bp部分，同时在尾端加入SalⅠ位点，扩增产物通过双酶切后连接到pRTL4的对应位置制得所述重组载体-pRTL5载体；或者

4’)pRTL1-HC质粒作为模板用于overlap PCR扩增目的片段573bp-1994bp部分，同时在5’端加入BamHⅠ位点，3’尾端加入ClaⅠ位点，扩增产物通过双酶切后连接到pRTL4的对应位置制得所述重组载体-pRTL6载体；

其中，所述pRTL5载体的核苷酸序列如SEQ ID NO：1所示，所述pRTL6载体的核苷酸序列如SEQ ID NO：2所示。

2.根据权利要求1所述的重组载体的构建方法，其特征在于，步骤1)中，所述双酶切的位点为pRTL1-LC上游1284bp处的NheⅠ酶切位点和和下游3029bp处的NdeⅠ酶切位点。

3.根据权利要求1所述的重组载体的构建方法，其特征在于，步骤2)中，所述双酶切的位点为pRTL2上游3973bp处的NotⅠ酶切位点和下游626bp处的EcoRⅠ酶切位点。

4.根据权利要求1所述的重组载体的构建方法，其特征在于，步骤3)中，所述双酶切的位点为pRTL3上游4132bp处的SalⅠ酶切位点和下游1295bp处的NheⅠ酶切位点。

5.根据权利要求1所述的重组载体的构建方法，其特征在于，步骤4)中，所述双酶切的位点为pRTL4上游3987bp处的NotⅠ酶切位点和下游4144bp处的SalⅠ酶切位点，或者

步骤4’)中，所述双酶切的位点为pRTL4上游1283bp处的BamHⅠ酶切位点和下游1291bp处的ClaⅠ酶切位点。

6.根据权利要求1-5中任意一项所述的重组载体的构建方法，其特征在于，所述pRTL1-LC和pRTL1-HC各自拥有启动子区。

7.根据权利要求6所述的重组载体的构建方法，其特征在于，所述pRTL载体的启动子为hEF1-HTLV启动子和/或组成型表达启动子GAP；

优选地，所述pRTL载体的信号肽选自外源蛋白自身的天然信号肽、IL2信号肽、Igkappa信号肽和hGHRH信号肽中的一种或多种。

8.由权利要求1-7中任意一项所述的方法构建的重组载体。

9.根据权利要求8所述的重组载体，其特征在于，所述重组载体的宿主细胞为大肠杆菌；

优选地，所述大肠杆菌为E.coliXLI-Blue。

10.权利要求8或9所述的重组载体在抗体表达中的应用。