[发明专利]转录调控因子TR2的突变体在制备维生素B12中的应用

说明书

本发明公开一种转录调控因子TR2的突变体在制备维生素B₁₂中的应用。在苜蓿中华根瘤菌中过表达的转录调控因子TR2，或其突变体基因的基因工程菌，其生产维生素B₁₂的能力得到了大幅提高，具有较大的应用推广价值。

本申请是申请号为202010012114.3，申请日为2020年1月7日，发明名称为“转录调控因子和其突变体及其在制备维生素B₁₂中的应用”的发明专利申请的分案申请。

技术领域：

本发明属于生物技术领域，具体涉及转录调控因子TR2的突变体在制备维生素B₁₂中的应用。

背景技术：

维生素B₁₂(VB₁₂)在药物和食品工业中具有广泛的应用，其又叫钴胺素，属于咕啉类化合物，是唯一含金属元素的维生素类化合物，是B族维生素发现最晚的大分子有机化合物。根据咕啉环上方的配基(R基团)种类不同，维生素B₁₂可分为：羟基钴胺素，脱氧腺苷钴胺素和甲基钴胺素。维生素B₁₂参与了大量的生化反应过程包括DNA的合成和调控、脂肪酸的合成、氨基酸的代谢及能力的产生。

由于维生素B₁₂分子结构复杂，化学法人工合成需要消耗大量的人力与物力，而且合成周期长。在合成过程中对操作人员的要求过高，导致不能大量的生产。微生物发酵法目前是生产维生素B₁₂的最廉价的方法，能够大量生产并推广其使用。

目前，国内外针对维生素B₁₂生产菌生物合成维生素B₁₂的研究主要集中在发酵过程优化，主要涉及培养基包括碳氮源和金属离子的优化、甜菜碱的添加、鱼藤酮的添加，工艺条件包括pH和供氧的控制等。有文献报道通过在脱氮假单胞菌基因组上表达单拷贝的透明颤菌vgb 基因来增加细胞生产维生素B₁₂的能力(程立芳等,不同来源的尿卟啉原III转甲基酶在脱氮假单胞菌中的表达及其对生产维生素B12的影响.工业微生物，2017，第47卷第3期)。

微生物拥有一系列通过调节自身基因的表达来使生物体适应不同环境的机制。在基因表达过程中，一种称为转录调控因子的蛋白质分子通过结合在特定的DNA区域调节特定基因的表达。然而，在产维生素B₁₂菌种中哪个转录调控因子影响维生素B₁₂的产量尚未见到报道。

发明内容：

本发明人前期筛选出了一株高产维生素B₁₂的苜蓿中华根瘤菌CGMCC NO.9638菌株(CN104342390A)，可发酵生产维生素B₁₂。通过对其进行诱变，获得产维生素B₁₂能力提高的诱变菌株，再挖掘分析其中能够增加产维生素B₁₂的能力转录调控因子，本发明其中两个转录因子TR1和TR2有重要影响，因而做了进一步研究，最终完成本发明，而提供两个转录调控因子和其突变体，以及它们制备维生素B₁₂中的应用。

因此，本发明首先提供一种转录调控因子基因TR1或TR2，其编码的多肽氨基酸序列分别如SEQ ID No.5或7所示。

优选地，其核苷酸序列分别如SEQ ID No.1或3所示。

进一步本发明提供所述的转录调控因子基因编码的多肽。

另外，本发明还提供一种转录调控因子TR1的突变基因，其编码的多肽氨基酸序列在SEQ ID No.5所示的氨基酸序列上具有第117位氨基酸替换V的突变，优选的其核苷酸序列如SEQ ID No.2所示；同时，提供一种转录调控因子TR2的突变基因，其在SEQ ID No.7所示的氨基酸序列上具有第235位氨基酸替换为F的突变，优选地核苷酸序列如SEQ ID No.4所示。

本发明还提供上述的转录调控因子的突变基因编码的多肽。