[发明专利]具有NK细胞及ADCC能力的人源化免疫系统小鼠的构建方法

权利要求书

1.一种具有NK细胞及ADCC能力的人源化免疫系统小鼠的构建方法，其特征在于，包括：

具有人工补充外源性细胞因子IL-15的步骤。

2.如权利要求1所述的具有NK细胞及ADCC能力的人源化免疫系统小鼠的构建方法，其特征在于：

补充细胞因子IL-15的方法包括AAV载体、质粒的高压水动力注射、FC化的长效细胞因子注射或者普通细胞因子注射。

3.如权利要求1所述的具有NK细胞及ADCC能力的人源化免疫系统小鼠的构建方法，其特征在于，包括：

步骤一：制作常规的人源化免疫系统小鼠；

步骤二：制备包装好的AAV载体，AAV载体中包含细胞因子IL-15基因；

步骤三：向常规的人源化免疫系统小鼠体内注射包装好的AAV载体。

4.如权利要求3所述的具有NK细胞及ADCC能力的人源化免疫系统小鼠的构建方法，其特征在于：

步骤一中，制作常规的人源化免疫系统小鼠的方法如下：

步骤1-1，选用新生小鼠，进行全身辐照清髓。射线的剂量为0.5-3Gy每只小鼠；

步骤1-2，经辐照处理后，对小鼠尾静脉注射CD34阳性的人源造血干细胞，注射剂量为1*104～1*106每只小鼠；

步骤1-3，干细胞接种8周后，对该人源化免疫系统小鼠的外周血中人源免疫细胞的比例和亚群进行流式检测，当外周血中人源免疫细胞占总免疫细胞数量超过15％，即能够用于新一代人源化免疫系统小鼠的构建。

5.如权利要求3所述的具有NK细胞及ADCC能力的人源化免疫系统小鼠的构建方法，其特征在于：

步骤二中制备AAV载体的步骤如下：

步骤2-1，根据IL-15的人源基因序列进行引物设计；

步骤2-2，扩增目的基因IL-15；

步骤2-3，将目的基因构建入线性化表达载体中，形成重组质粒；

步骤2-4，制备感受态细胞；

步骤2-5，将重组后的质粒转化到感受态细胞中；

步骤2-6，使用菌落PCR鉴定阳性转化子；

步骤2-7，提取构建成功的质粒；

步骤2-8，将质粒包装到AAV病毒载体中。

6.如权利要求3所述的具有NK细胞及ADCC能力的人源化免疫系统小鼠的构建方法，其特征在于：

步骤三中，尾静脉注射包装好的AAV病毒载体，剂量范围为1*10⁹～2*10¹¹每只小鼠。

7.如权利要求5所述的具有NK细胞及ADCC能力的人源化免疫系统小鼠的构建方法，其特征在于：

AAV病毒包装完成后，还具有AAV对293T细胞的表达验证的步骤：

步骤2-10：总蛋白抽提：将病毒与293T细胞共同培养48小时后，离心洗涤并分离细胞，将细胞裂解后提取总蛋白，

步骤2-11：测蛋白浓度，

步骤2-12：样品制备，

步骤2-13：SDS-PAGE凝胶电泳，

步骤2-14：转膜，

步骤2-14：免疫反应，成像仪拍照。

8.如权利要求2所述的具有NK细胞及ADCC能力的人源化免疫系统小鼠的构建方法，其特征在于：

Fc化细胞因子注射的方法如下：

制备Fc化细胞因子：

步骤4-1，IL-15功能基因的克隆；

步骤4-2，人IgG Fc基因的克隆；

步骤4-3，Fc融合蛋白表达质粒的构建；

步骤4-4，将表达质粒转入受体细胞，并筛选高表达细胞株；

步骤4-5，IL-15与Fc融合蛋白的纯化：收集高表达细胞株的表达产物，分离提纯；

然后将IL-15与Fc的融合蛋白注射给常规的人源化免疫系统小鼠。