[发明专利]RPL19基因作为广聚萤叶甲内参基因的应用

说明书

本发明属于农业生物技术领域，具体涉及RPL19基因作为广聚萤叶甲内参基因的应用。本发明筛选了12个广聚萤叶甲候选内参基因，获得候选内参基因的基因序列，设计简并引物，克隆得到广聚萤叶甲中上述候选基因的部分核苷酸序列，并基于该序列设计特异性定量引物，利用SYBR GreenI染料技术的RT‑qPCR方法，筛选出了广聚萤叶甲不同发育时期及性别、不同组织、不同体型雄虫中稳定表达的内参基因，为开展广聚萤叶甲基因功能研究提供了稳定内参基因。

技术领域

本发明属于农业生物技术领域，具体涉及RPL19基因作为广聚萤叶甲内参基因的应用。

背景技术

广聚萤叶甲(Ophraella communa)，属鞘翅目(Coleoptera)叶甲科(Chrysomelidae)，源于北美洲，是恶性入侵杂草-豚草的重要安全性天敌。由于豚草的入侵性极强，其已由南至北扩散至我国多个省市，防治的难度增大。豚草天敌-广聚萤叶甲其幼虫和成虫可大面积取食豚草叶片，成虫也可取食其花序，并呈火烧状推进，能够从根源上对恶性豚草加以控制、防除，且该天敌对环境友好，经济成本低，故是一种最佳防治方案。了解广聚萤叶甲的生理及行为的分子机制有助于更有效的提高广聚萤叶甲在豚草防治中的性能。然而现有技术对其分子生物学层面的研究开展极少，基因信息极其匮乏。

在分子生物学研究中，明确基因表达水平对于研究基因的功能至关重要。在众多定量基因表达水平的方法中，实时荧光定量PCR因其准确、特异、灵敏、快速等优点而被广泛应用。然而RT-qPCR的检测结果经常受到诸如样本差异、cDNA合成效率差异以及引物性能等多种因素的影响。为了消除不确定因素带来的误差，通常以表达量恒定的管家基因作为参照物对定量的数据进行归一化处理。管家基因数目众多，不同的研究对象、不同的实验条件下，表达量稳定的管家基因也不尽相同。因此，在明确实验目的前提下，首先应该验证并获得稳定表达的管家基因。然而，现有技术还没有广聚萤叶甲内参基因的相关报道。

发明内容

本发明的目的在于提供一种RPL19基因作为广聚萤叶甲内参基因的应用。

根据本发明具体实施方式的RPL19基因作为广聚萤叶甲内参基因的应用，所述RPL19基因通过以下引物扩增得到RPL19的基因序列

F:5’-GGAAGGCATTGTGGATTTGG-3’，

R:5’-CATTACCCTTAGCTTTCATG-3’。

根据本发明的具体实施方式，本发明筛选的12个内参基因包括内参基因为肌动蛋白基因(ACT1)、肌动蛋白基因(ACT2)、3-磷酸甘油醛脱氢酶基(GAPDH)、核糖体蛋白L4基因(RPL4)、核糖体蛋白L19基因(RPL19)、核糖体蛋白S18基因(RPS18)、延伸因子1α基因(EF1A)、β-微管蛋白C基因(βTUBC)、琥珀酸脱氢酶(SDH)、ADP核糖基化因子1基因(ARF1)、ADP核糖基化因子4基因(ARF4)、细胞色素氧化酶基因(COX)，其中，RPL19基因可以在不同发育时期、不同性别以及不同体型雄虫精巢和附腺中稳定表达。

本发明获得广聚萤叶甲不同发育时期及性别中稳定表达的RPL19基因，其可作为广聚萤叶甲相关分子生物学实验中的内参基因或者功能基因，填补了广聚萤叶甲内参基因筛选的空白。

附图说明

图1-1，图1-2显示广聚萤叶甲各候选内参基因引物在进行荧光定量PCR实验时的标准曲线；

图2-1，图2-2，图2-3，图2-4显示广聚萤叶甲各候选内参基因引物在进行荧光定量PCR实验时的溶解曲线；

图3显示广聚萤叶甲各候选内参基因的表达水平，其中，广聚萤叶甲候选内参基因表达水平由所有试验条件下的原始Ct值表示；箱型上下线分别为上四分位数和下四分位数，中线为中位数，中垂线的上下限分别为最大值和最小值；