[发明专利]用于检测JAK2 V617F及CALR第九外显子基因突变的PCR引物组及试剂盒

说明书

本发明属于基因检测技术领域，特别涉及一种用于检测JAK2V617F及CALR第九外显子基因突变的PCR引物组及试剂盒，将多重PCR和基于毛细管电泳技术的遗传分析系统相结合，在一个PCR反应系统中同时完成JAK2V617F与CALR第九外显子基因突变检测；采用毛细管电泳片段分析法分析PCR产物片段由于具有高分辨率，因此即使出现非特异扩增也能识别，而传统手段只能在特定片段大小位点出现荧光信号才可判读为阳性；具有高灵敏度，可识别最低0.1ng/uL DNA中的突变，以及最少0.1％的突变；通量高，使用该方法可同时分析96个标本的基因突变情况，可应用于大规模疾病筛查。

技术领域

本发明属于基因检测技术领域，特别涉及一种用于检测JAK2 V617F及CALR第九外显子基因突变的PCR引物组及试剂盒。

背景技术

BCR-ABL阴性的骨髓增殖性肿瘤(myeloproliferative neoplasms，MPN)真性红细胞增多症(polycythemia vera，PV)、原发性血小板增多症(essential thrombocythemia，ET)和原发性骨髓纤维化(primary myelofibrosis，PMF)等疾病。此类疾病主要是因为人体正常基因发生突变而造成骨髓细胞一系或多系增生活跃。因此发现及检测基因突变成为MPN的主要诊断方法。近年来的研究表明在MPN患者中主要存在JAK2(Janus kinase 2)、CALR(calreticulin)、MPL(myeloproliferative leukemia virus gene)等基因的突变，JAK2、CALR以及MPL基因突变已成为诊断MPN的主要标准。其中JAK2 V617F突变在PV中阳性率可高达95％，在ET与PMF中的突变率达50％以上，同时20％-30％的ET和PMF患者中存在CALR基因第九外显子的缺失(CALRL367 fs*46，52bp缺失)或者插入(CALRL385 fs*47，5bp插入)突变，因此对JAK2 V617F以及CALR第九外显子基因突变检测对诊断MPN具有非常重要的意义。

检测JAK2 V617F以及CALR基因突变的方法主要有荧光定量PCR法、高分辨熔解曲线法、直接测序法等。以上方法在检测MPN基因突变的应用已经在文献中相继报道，检测技术相对成熟且已经有商品化试剂盒供临床诊断使用。由于JAK2 V617F是点突变，可以使用突变扩增系统PCR(amplification refractory mutation system,ARMS-PCR)通过PCR和琼脂糖凝胶电泳或者实时荧光PCR即可检测出DNA中已知突变，但是CALR第九外显子的突变多属于小片段的缺失和插入突变，普通的琼脂糖凝胶电泳由于对扩增产物的分辨力有限，无法精确分辨出CALR基因突变，需要对PCR产物进一步的进行基因测序准确分析。使用普通的凝胶电泳分析，无法在同一个PCR反应管中同时检测JAK2 V617F、CALR基因突变。实时荧光PCR检测多基因突变时，每个突变位点都要设计特异性荧光探针，且同一标本需要进行多管PCR反应，时间与经济成本相对较高。

基于多重PCR技术和基于毛细管电泳技术的遗传分析系统片段分析功能进行多基因检测已经广发应用于微生物病原检测、基因表达分析等分子检测领域。但是使用基于毛细管电泳技术的遗传分析系统片段分析功能同时检测JAK2V617F及CALR第九外显子的缺失或者插入突变的相关报道国内外还未见。

发明内容

为解决现有技术的不足，本发明的目的在于提供一种用于检测JAK2 V617F及CALR第九外显子基因突变的PCR引物组及试剂盒，将多重PCR和基于毛细管电泳技术的遗传分析系统相结合，在一个PCR反应系统中同时完成JAK2V617F与CALR第九外显子基因突变检测，以期可以开发出一种快速、便捷诊断MPN疾病基因突变的检测试剂盒。

为了实现上述目标，本发明采用如下的技术方案：