[发明专利]检测正呼肠孤病毒的染料荧光定量引物及试剂盒

说明书

本发明涉及一种染料荧光定量RT‑PCR引物、试剂盒及其应用。该引物包括上游引物MRV F和下游引物MRV R，并且所述上游引物MRV F的核苷酸序列如SEQ ID NO:1所示，所述下游引物MRV R的核苷酸序列如SEQ ID NO:2所示。本发明的特异性引物及试剂盒可对哺乳动物正呼肠孤病毒进行快速、准确地鉴别，具有简单、快速、灵敏度高和特异强的特点。

技术领域

本发明属于病毒检测技术领域，具体涉及一种检测哺乳动物正呼肠孤病毒的染料荧光定量RT-PCR引物及试剂盒。

背景技术

呼肠孤病毒(Reovirus)是1954年由Sabin,Ramos-Alvarez等从健康儿童的呼吸道与胃肠道中分离得到的，最初认为该病毒与任何疾病都不相关，因此将其命名为呼吸道(Respiratory)、肠道(enteric)、孤儿(orphan)病毒，取3个英文单词的词头，缩写为——呼肠孤病毒(Reovirus)。近年来，哺乳动物正呼肠孤病毒作为呼吸道和消化道疾病的病原受到各国学者的关注。自20世纪50年代起，MRV(哺乳动物正呼肠孤病毒)先后在人类、狗、牛、水貂、果子狸、蝙蝠等哺乳动物上被分离到。MRV被证实不仅能引起人类出血性肠炎、急性呼吸道感染、脑炎等疾病，还能导致其他哺乳动物如狗、水貂等腹泻。

目前，能准确、快捷、有效的检测哺乳动物正呼肠孤病毒对于提高对该病毒的防控是至关重要的。根据研究数据表明，该病毒的基因序列变异快，不同毒株之间基因序列差异大，目前国外已有研究者建立了该病毒的检测体系，但其方法在国内并不适用，而国内已有的普通PCR和荧光检测试剂盒又常常出现假阳性问题，因此其检测结果的准确性有待考究。由此可见，我国对于该病毒的检测技术还需要进一步的完善。

发明内容

针对现有技术存在的问题，本发明提供一种检测哺乳动物正呼肠孤病毒的荧光定量RT-PCR引物及试剂盒，该特异性引物及试剂盒可对哺乳动物正呼肠孤病毒进行快速、准确地鉴别，具有简单、快速、灵敏度高和特异强的特点。

本发明的技术方案为：

第一个方面，本发明提供一种检测哺乳动物正呼肠孤病毒的染料荧光定量RT-PCR引物，包括上游引物MRV F和下游引物MRV R，并且所述上游引物MRV F的核苷酸序列如SEQID NO:1所示，所述下游引物MRV R的核苷酸序列如SEQ ID NO:2所示。

第二个方面，本发明提供一种检测哺乳动物正呼肠孤病毒的试剂盒，包括上述染料荧光定量RT-PCR引物。

进一步的，所述试剂盒还包括：(1)基因扩增试剂、(2)PCR纯化试剂盒、(3)质粒提取试剂盒。

采用上述检测哺乳动物正呼肠孤病毒的试剂盒进行哺乳动物正呼肠孤病毒检测的方法，包括以下步骤：提取待检测样品的RNA，以待检测样品的RNA为模板，反转录得到cDNA，用上述的引物对cDNA进行染料荧光定量RT-PCR扩增；通过实时荧光定量PCR仪进行结果的读取，判断S型扩增曲线和CT值，在扩增曲线正常的情况下，若0＜CT值＜35时，则可记为阳性，若CT值＝0时，则可记为阴性。

进一步的，所述的反转录步骤包括：将RNA模板4μL、1号5×Prime Script Buffer4μL、2号Prime ScriptRT Enzyme Mix 1μL、4号Random 6mers 2μL和5号RNase Free dH₂O9μL混匀，放入PCR仪上进行反转录。

进一步的，所述的反转录反应条件为：37℃15min，85℃15s，16℃10min。

进一步的，所述的染料荧光定量RT-PCR扩增的反应检测体系为：TB Green II 10μL，上游引物MRV F、下游引物MRV R各0.5μL，cDNA模板1μL，用ddH2O补齐到20μL。