[发明专利]一种番鸭呼肠孤病毒和新型鸭呼肠孤病毒双重TaqMan荧光定量RT-PCR检测试剂盒

说明书

本发明提供一种番鸭呼肠孤病毒和新型鸭呼肠孤病毒双重TaqMan荧光定量RT‑PCR检测试剂盒，所述试剂盒包括2对引物和2条探针，具体序列如SEQ ID NO.1‑6所示。本发明通过所述试剂盒建立能够同时对鸭群中番鸭呼肠孤病毒和新型鸭呼肠孤病毒鉴别诊断的一步法检测方法，程序快速、简便、特异性强。目前，还没有基于TaqMan‑MGB的双重实时荧光定量PCR检测引物及方法可以同时鉴别检测MDRV和NDRV的发明专利，本研究可以填补这方面的空白。

技术领域

本发明属于预防兽医学领域，涉及番鸭呼肠孤病毒（MDRV）和新型番鸭呼肠孤病毒（NDRV）双重TaqMan实时荧光定量RT-PCR检测引物、探针，具体涉及用于同时检测MDRV和NDRV多重TaqMan 实时荧光定量RT-PCR方法的试剂盒。

背景技术

番鸭呼肠孤病毒(Muscovy duck Reovirus, MDRV)，是引起7 -45日龄雏番鸭软脚、水性腹泻、急性死亡和发育迟缓的急性传染病，剖检以引起肝脏和脾脏肿大，并有大量白色针头样坏死灶为典型特征。MDRV最早于1972年法国学者分离鉴定，1997年开始该病在我国的福建、浙江、广东、江苏和江西等番鸭饲养区暴发流行，由于其感染的高发病率(30～90%)和死亡率(18 ～72%)。

2005年以来在福建、广东和浙江等地番鸭、半番鸭和麻鸭群中暴发一种以肝脏 、脾脏不规则斑块出血和坏死、多器官出血为主要特征的“鸭出血性坏死性肝炎”。由陈少莺课题组首次分离并鉴定出该病的病原是一种有别于番鸭呼肠孤病毒、禽呼肠孤病毒(AvainReovirus，ARV) 的新型鸭呼肠孤病毒(Novel duck Reovirus ，NDRV)。与之前所述的所有DRV感染相比，NDRV感染表现出明显的生物学特征，其具有更高的毒力和更广泛的宿主种类，该病的发病日龄为6～25日龄，发病率为5％～20％，死亡率为3％～16％，且日龄越小，发病率、病死率越高。

MDRV和NDRV之间生物学特征差异较大，抗原相关性低。由于禽呼肠孤病毒是一种分节段病毒，不同毒株同一节段内核苷酸序列具有不同的相似性。禽源呼肠孤病毒S3基因编码的σB蛋白，是病毒外衣壳主要成分，能诱导机体产生群特异性中和抗体。研究表明，MDRV和NDRV的S3基因处在不同的进化分支，具有不同的分子特征，核苷酸和氨基酸的同源性仅为58.2%～62.7%和63%～70.4%。虽然MDRV和NDRV临床诊断上可通过病鸭肝脏不同的剖检情况进行初步判断区分，只凭临床诊断剖检不能确定是否存在二者混合感染的可能，必须通过分析分离病毒对易感细胞与实验室禽类的致病性进行鉴别判断。同时水禽呼肠孤病毒属于免疫抑制性病毒，与其他病原体的共感染增强了禽源呼肠孤病毒的致病性，同时也会造成疫苗免疫后免疫效果不佳的情况，使禽源呼肠孤病毒的诊断和控制变得复杂。因此，对MDRV和NDRV两种疾病的早期诊断和种鸭感染状况筛查显得尤为重要，建立一种快速、敏感、特异的检测方法是防控这两种疾病的前提。

目前MDRV和NDRV的常用诊断技术主要有病毒分离与鉴定、常规RT-PCR检测技术、免疫荧光实验、RT-LAMP、常规RT-PCR检测方法等。然而这些方法都存在费时费力，容易交叉污染出现假阳性等问题，且只可对特定基因进行扩增，但不能进行定量分析。而实时荧光定量 PCR技术在PCR反应体系中加入荧光基团，利用荧光积累实时监测整个PCR进程，最后通过标准曲线对未知模板进行定量分析。MGB探针技术是近几年研发的一种新型探针技术，它是将MGB分子结合到DNA螺旋小沟，通过稳定MGB探针模板提高杂交稳定性，使短至15个碱基的探针获得高错配区分辩别能力。MGB探针包括一个不发荧光的淬灭基团（NFQ），极大消除传统淬灭基团产生的背景荧光，增加Tm值，提高信噪比，从而提高检验灵敏性等优点。TaqMan-MGB 实时荧光定量PCR技术不仅准确检测出样品中的基因数目，具有灵敏度高、特异性强的优势，有效地避免了实验室交叉污染，可在较短的时间内得到结果，有效解决PCR污染问题。