[发明专利]一种快速降解污水中氮素的菌株的检测方法及其应用

权利要求书

1.一种快速降解污水中氮素的菌株的检测方法，其特征在于，所述快速降解污水中氮素的菌株的检测方法包括以下步骤：

步骤一，获取快速降解污水中氮素的菌株的样本，得到快速降解污水中氮素的菌株标准品；

步骤二，建立快速降解污水中氮素的菌株标准品的浓度与临界循环数对应的标准曲线；

步骤三，对步骤一中的快速降解污水中氮素的菌株的样本进行PCR扩增及电泳确认，建立快速降解污水中氮素的菌株的样本的浓度与临界循环数对应的标准曲线；

步骤四，根据所述快速降解污水中氮素的菌株的样本的浓度与临界循环数对应的标准曲线，得到快速降解污水中氮素的菌株的样本中所述菌株基因的拷贝数，即得到所述快速降解污水中氮素的菌株的样本中菌株的数量。

2.如权利要求1所述的快速降解污水中氮素的菌株的检测方法，其特征在于，所述快速降解污水中氮素的菌株的样本的获取方法为：

(1)收集污水5mL，将其滴加至盛有30mL富集培养液的三角瓶中，28℃培养3-5天；

(2)取培养后的液体滴至平板上，采用稀释涂布平板法分离；

(3)28℃条件下培养2天，落入斜面的菌株即为快速降解污水中氮素的菌株的样本。

3.如权利要求1所述的快速降解污水中氮素的菌株的检测方法，其特征在于，所述快速降解污水中氮素的菌株标准品包含所述菌株基因的重组质粒或重组细胞。

4.如权利要求1所述的快速降解污水中氮素的菌株的检测方法，其特征在于，所述快速降解污水中氮素的菌株标准品的制备方法如下：

(1)针对所述可降解污水中氮素的菌株的基因设计特异性的引物；

(2)取所述快速降解污水中氮素的菌株的样本，利用DNA提取试剂盒进行总DNA提取纯化，得到DNA样本，并以所述DNA样本为模板进行PCR扩增；

(3)对PCR扩增产物进行纯化，并将纯化后的PCR扩增产物与质粒载体链接，得到转化了质粒的白色菌落；

(4)选取饱满的菌落接种于培养液中，培养过夜，利用质粒提取试剂盒提取质粒，得到快速降解污水中氮素的菌株标准品。

5.如权利要求1所述的快速降解污水中氮素的菌株的检测方法，其特征在于，所述PCR扩增的方法为：

对快速降解污水中氮素的菌株的样本的DNA进行提取；

进行PCR扩增体系的构建；

进行PCR反应。

6.如权利要求4所述的快速降解污水中氮素的菌株的检测方法，其特征在于，进行PCR反应，95℃与变形3min，然后93℃变性30s，55℃退火30s，72℃延伸3min；45个循环，最后70℃延伸4min。

7.如权利要求4所述的快速降解污水中氮素的菌株的检测方法，其特征在于，所述PCR扩增体系的构建的方法为：

1)将质粒标准品进行若干倍梯度稀释，作为定量PCR模板DNA，进行实时定量PCR扩增；

2)按照试剂盒说明进行操作，加入实时定量PCR所需试剂，PCR反应体系为20μL，加入2μL质粒标准品作为反应模板，进行实时定量PCR反应；

3)以去离子水作为阴性对照，以标准品稀释梯度的对数值为横坐标，以临界循环数为纵坐标建立实时定量PCR的标准曲线。

8.如权利要求6所述的快速降解污水中氮素的菌株的检测方法，其特征在于，所述PCR反应体系为：3μL质量比为50％的甘油、1μL二甲基亚砜、1μL浓度为2.5mol/L的脱氧核糖核苷三磷酸、2μL浓度为25mmol/L的Tris-HCl、2μL浓度为25mmol/L的MgCl₂、0.5μL浓度为2U/L的Taq酶、引物两条。

9.如权利要求1所述的快速降解污水中氮素的菌株的检测方法，其特征在于，所述PCR扩增产物在琼脂糖凝胶电泳仪上进行电泳确认。