[发明专利]一种突变LATS1质粒的构建与应用

说明书

本发明公开了一种突变LATS1质粒的构建与应用，属于生物医学技术领域。该突变LATS1质粒的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示。本发明构建的突变LATS1质粒可阻碍SPOP对LATS1蛋白的泛素化降解作用，从而可以发挥对肾癌细胞侵袭的抑制作用和对周期的阻滞作用。

技术领域

本发明属于生物医学技术领域，具体涉及一种突变LATS1质粒的构建与应用。

背景技术

肾癌是一种常见的恶性肿瘤，约占所有癌症类型的4％。尽管肿瘤诊断治疗水平已经取得较大进步，分子靶向治疗也获得了广泛应用，但晚期肾癌患者预后仍然较差，主要是由于肾癌容易发生复发和转移。

LATS1(Large tumor suppressor 1)蛋白是一种细胞增殖抑制因子，过表达LATS1能将细胞周期阻滞在G2/M期进而抑制细胞增殖。SPOP(Speckle-type POZ protein)是一种在肾透明细胞癌中过表达的E3泛素连接酶，表达异常的SPOP可促进肾肿瘤细胞增殖和肾癌的恶性进展，但其机制仍然不清楚。对SPOP的研究显示过表达SPOP能增强肾癌细胞增殖和侵袭，而沉默SPOP表达能抑制肾癌细胞的增殖侵袭。通过前期筛查发现LATS1蛋白的氨基酸序列含有两个SBC(SPOP-binding consensusmotif)基序，可能是SPOP泛素化降解的底物。因此，SPOP可能是通过促进LATS1蛋白的泛素化降解来促进肾癌细胞的增殖和侵袭，而LATS1蛋白则可以作为肾癌治疗的靶标之一，调控肾癌细胞的增殖侵袭。

发明内容

本发明的目的是提供突变LATS1质粒的构建与应用，通过设计突变LATS1质粒，使LATS1蛋白发生突变，从而抑制SPOP泛素化降解LATS1，实现抑制肾癌细胞增殖。

为了实现上述发明目的，本发明采用以下技术方案：

突变LATS1质粒，其核苷酸部分序列如SEQ ID NO.1所示。

上述突变LATS1质粒的构建方法，包括以下步骤：

步骤1，以原Flag-LATS1质粒为模板，其核苷酸部分序列如SEQ ID NO.2所示，采用PCR分段扩增的方法进行PCR扩增，所用引物组合物如下：

Flag-Lats1突变-A-nhe1：序列如SEQ ID NO.3所示，

Flag-Lats1突变-D-xho1：序列如SEQ ID NO.4所示，

Flag-Lats1突变-B：序列如SEQ ID NO.5所示，

Flag-Lats1突变-C：序列如SEQ ID NO.6所示，

扩增条件为95℃预变性10分钟；95℃变性30秒，60℃退火30秒，72℃延伸1分钟，共35个循环；最后70℃延伸10分钟；进行三轮扩增；

步骤2，使用nheΙ和xhoΙ双酶切，连接，转化，成功构建突变LATS1质粒。

上述突变LATS1质粒在制备抑制肿瘤细胞迁移和增殖药物中的应用。

进一步地，所述肿瘤细胞为肾癌细胞。

本发明构建的突变LATS1质粒可阻碍SPOP对LATS1蛋白的泛素化降解作用，从而可以发挥对肾癌细胞侵袭的抑制作用和对周期的阻滞作用。

附图说明

图1为引物扩增位置示意图。

图2为pcDNA3.1(+)载体图谱。

图3为实施例2中用野生型LATS1质粒、His-Ub质粒分别和SPOP质粒共转染293T细胞后LATS1蛋白质泛素化水平。