[发明专利]一种基于宏基因组技术识别水体中携带毒性因子病原菌的方法

说明书

本发明属于水生态安全领域，具体涉及一种基于宏基因组技术识别水体中携带毒性因子病原菌的方法。本方法通过宏基因组测序技术及组装基因的方法，在基因水平上明确水体中毒性因子的种类和数量，识别其病源宿主信息，从而确定水体中携带毒性因子的病原菌及其潜在的健康风险。该方法具有高通量、快速简便的特点，适用于大规模的采样调查研究。

技术领域

本发明涉及一种识别水体中病原菌的方法，具体涉及一种基于宏基因组技术识别水体中携带毒性因子病原菌的方法，属于水生态安全领域。

背景技术

现代的人类生产活动使得河流水环境质量下降，生态功能退化，同时相应的生态健康风险也会逐渐上升。而识别水生态环境中的病原菌是生态健康风险评价的重要内容。通常用于识别检测病原菌的方法有纯培养法和基于PCR技术的分子检测方法。传统纯培养法具有较长的培养周期和复杂的培养条件使得该方法难以应用于大规模的生态调查；基于PCR技术的分子检测方法则严重受限于扩增目的基因引物的特异性，而很难全面识别水体中病原菌的分布。大量的研究表明病原菌的致病性主要依赖于位于其遗传物质内的毒性因子(VFs)，而一种病原菌可以同时携带一种或者多种毒性因子，同时病原菌的致病性与其携带的毒性因子的种类和数量有关。例如：携带进攻型毒性因子的病原菌更容易侵入宿主体内使其感染；而运动型的毒性因子可以使病原菌主动附着在适宜其繁殖的生态位，形成生物膜保护其免受外界攻击。如果能对毒性因子进行识别和溯源，就可以更加全面的评估水体中病原菌的健康风险水平。

本发明提供一种基于宏基因组技术识别水体中携带毒性因子病原菌的方法，用于水环境健康风险的评价。通过宏基因组测序技术及组装基因的方法，对样品中的毒性因子进行检测、分类以及溯源，从而确定环境中携带毒性因子的病原菌及其健康风险水平。

发明内容

本发明的目的是提供一种基于宏基因组技术，在基因水平上识别水体中携带毒性因子病原菌的方法。该方法可以提供潜在病原菌的基因信息，以用于环境中微生物健康风险评价。具体方案如下：

一种基于宏基因组技术识别水体中携带毒性因子病原菌的方法，步骤如下：

(1)获取水体待测样本的宏基因组DNA；

(2)基因组组装：对所述宏基因组DNA进行拼接组装，依据完整性50％、污染率10％，筛选非冗余组装基因组MAGs；

(3)毒性因子的识别与分类：采用软件对所述基因组MAGs进行功能基因预测，同时基于病原菌数据库对所述基因组MAGs中的毒性因子进行识别和分类；

(4)毒性因子的溯源：当携带所述毒性因子的基因组MAGs的宿主满足与已知病原菌的核酸序列的同源性大于等于80％，且所述基因组MAGs的毒性因子与所述宿主的相似度满足条件：p0.05,Spearman(斯皮尔曼相关系数)0.6，则将所述宿主定义为携带毒性因子的病原菌。

优选地，所述步骤(1)中，水体待测样本经提取总DNA后，应用Illumina测序平台的Hiseq X–Ten paired-end 150bp模式对基因进行扩增和测序；待测试样品下机后，去除嵌合体、去除质量分数≤32或包含10％的不明确碱基的序列，获得原始宏基因组DNA数据。

优选地，所述步骤(1)中，所述水体待测样本通过水体过0.45μm的滤膜获得。

优选地，所述步骤(1)中，水体待测样本的总DNA采用试剂盒提取，选用DNeasyPowerWater Kit试剂盒进行提取。

所述步骤(1)中，本发明主要是基于宏基因组技术对毒性因子进行识别。选择Illumina测序平台的Hiseq X–Ten paired-end 150bp模式进行具有以下优点：高通量、速度快、测序周期短和实验成本低。适用于大规模的生态健康风险调查研究。