[发明专利]一种分离八仙花萼片着色细胞原生质体的方法

说明书

本发明涉及原生质体分离技术领域，公开了一种分离八仙花萼片着色细胞原生质体的方法，包括处理八仙花萼片、酶解、纯化和储存。本发明专门针对八仙花萼片的组织质密紧实、酶液不易浸入的特点，利用温和的酶解反应，在不损害八仙花萼片的细胞活性的条件下有效的提取出了八仙花萼片着色细胞原生质体，并且能清晰准确的辨别解离出的细胞颜色，为有针对性的对八仙花萼片中的特定着色细胞原生质体的基因水平、蛋白水平和代谢水平的研究奠定了基础。

技术领域

本发明涉及原生质体分离技术领域，具体涉及一种分离八仙花萼片着色细胞原生质体的方法。

背景技术

八仙花又名绣球、紫阳花，为虎耳草科八仙花属植物，是常见的盆栽观赏花木。由于八仙花的粉色花瓣在不同的栽培条件下可变为紫色或蓝色，从而大大提高了其观赏价值和商业价值，研究发现这是由于八仙花花萼片的着色细胞液泡的生理生化状态不同而导致的。八仙花不同于其它观赏植物的着色层位于花瓣表皮，八仙花萼片的着色细胞位于表皮下层，与无色叶肉细胞位于同一组织中，所以仅靠机械分离不仅难以区分无色及着色细胞，不能对着色细胞在基因水平、蛋白水平和代谢等水平做更精细的研究，还会造成着色细胞失活和花色降解等状况发生，更不利于对着色细胞的后续研究。

目前酶解提取原生质体时大都选择组织疏松、细胞间空间较大的组织作为材料，从而使得酶解液能够浸入，使纤维素酶能够将细胞从组织上游离下来，能破除胞壁纤维素，果胶酶也能及时分解果胶。并且去除细胞壁后荧光染料等物质也能更易进入植物细胞中，能够更好的分析细胞微环境对细胞形成、生长、发育的影响。但是八仙花萼片的组织质密紧实，酶液不易浸入，单纯靠普通的处理方法并不能获得足量的原生质体。因此，发明人发明了一种分离八仙花萼片着色细胞原生质体的方法。

发明内容

基于以上问题，本发明提供一种分离八仙花萼片着色细胞原生质体的方法，本发明能有效提取出八仙花萼片中的着色细胞原生质体，为进一步对八仙花萼片中的着色细胞的研究奠定了基础。

为解决以上技术问题，本发明提供了以下技术方案：

一种分离八仙花萼片着色细胞原生质体的方法，包括以下步骤：

S1：处理八仙花萼片

将八仙花的花簇采下，插入水中，在冰箱冷藏室4℃冷藏1～2小时，取0.5g冷藏后的萼片，用尖头镊子分离萼片的表皮与叶肉；

S2：酶解

将步骤S1中的萼片的叶肉迅速放入10ml酶解液中酶解，其中酶解液的组成成分包括25mM MES-Tris pH＝6.3、6％纤维素酶、0.6％离析酶、0.6M甘露醇、1mM CaCl2和0.1％BSA；酶解方式如下：先配制25mM MES-Tris pH＝6.3、6％纤维素酶、0.6％离析酶和0.6M甘露醇的溶液，并将上述溶液放入55℃恒温水浴锅中水浴10min，激发酶的活性，并使甘露醇充分溶解；待上述溶液自然冷却后再向上述溶液中加入1mM CaCl2和0.1％BSA，并混匀；然后取上述溶液10ml转入离心管中，再将经步骤S1处理之后的萼片的叶肉放入离心管中，之后抽真空至萼片的叶肉不再悬浮于酶解液的表面后，将离心管放入恒温震荡培养箱中，于30rpm 28℃暗孵育3h；

S3：纯化

将经步骤S2处理之后的酶解混合物用200目网筛过滤，将过滤后所得的液体放入低温离心机中于4℃70g离心5min，弃上清，用W5洗液轻轻吹打清洗离心后的沉淀物，并重复上述离心过程两次；W5洗液的组成成分如下：54mM NaCl，125mM CaCl2，5mM KCl，pH＝6.02mM MES-Tris；

S4：储存

向经步骤S3处理后的沉淀物中滴入100μL储存液，4℃避光保存，备用；所用储存液的组成成分如下：20mM pH＝6.0MES-Tris，0.6M甘露醇，2mM MgSO4，5mM EGTA，10mM KCl，2％甘油。