[发明专利]一种负载MSCs来源外泌体的口服微球的制备方法及应用

权利要求书

1.一种负载MSCs来源外泌体的口服微球，其特征在于：其制备方法包括以下步骤：

（1）ALG/CST外核溶液的配制：

分别称取海藻酸钠ALG和壳聚糖CST，各加入到双蒸水中分散，分别制备海藻酸钠溶液和壳聚糖溶液，充分溶解；冷却至室温后将二者按照一定比例混合，充分搅拌直至均匀；

（2）ALG/CNC内核溶液的配制：

分别称取海藻酸钠ALG和羟甲基纤维素钠CNC-Na，各加入到双蒸水中分散，分别制备海藻酸钠溶液和羟甲基纤维素钠溶液，充分溶解；冷却至室温后将二者按照一定比例混合，充分搅拌直至均匀；

（3）分离间充质干细胞来源的外泌体：

选取处于对数生长期的MSCs用于外泌体的提取，采用MSC完全培养基培养，当细胞生长至70~80％融合度时，将MSC完全培养基更换为含5％无外泌体血清的培养基，继续培养36~72小时；收集细胞培养上清，采用超速离心法提取外泌体；

（4）制备负载MSCs外泌体的微球：

将MSCs来源的外泌体按一定密度均匀混合于ALG/CNC内核溶液，将混合了外泌体的ALG/CNC内核溶液和ALG/CST外核溶液分别置于同轴电喷装置的相应注射器中，通过同轴电喷技术，在高电压的作用下将混合溶液喷射到氯化钙溶液中，获得包裹外泌体的微凝胶液滴，通过电压、流速、接收距离及内外轴直径大小进行调控内外核大小及壁厚；

步骤（1）中，ALG/CST外核溶液的浓度质量分数为1%ALG/1%CST；

步骤（2）中，ALG/CNC内核溶液的浓度质量分数为1%ALG/2%CNC；

步骤（3）中，超速离心的条件为：50,000~65,000 rpm，4°C，1~2小时；外泌体的浓度为100μg/ml；

步骤（4）中，将MSC来源的外泌体按一定密度均匀混合于ALG/CNC内核溶液，所述的一定密度为10-200μg/ml；

步骤（4）中，通过同轴电喷技术，在高电压的作用下将混合溶液喷射到氯化钙溶液中，反应参数设定及条件为：电压为4~8 kV，流速为30~50 µl/min，接收距离为8~10 cm；内相毛细管直径为80~150μm；中间相玻璃毛细管直径为：300~500μm。

2.根据权利要求1所述的负载MSCs来源外泌体的口服微球，其特征在于：步骤（4）中，同轴电喷技术反应参数设定及条件为：电压为5 kV,流速为30 µl/min,接收距离为8~10 cm；内相毛细管直径为100μm；中间相玻璃毛细管直径为：300 μm；方管直径为1 mm；外相收集管直径为：850μm。

3.根据权利要求1所述的负载MSCs来源外泌体的口服微球，其特征在于：步骤（4）中，氯化钙溶液的浓度范围是1%~2%w/w。

4.根据权利要求1所述的负载MSCs来源外泌体的口服微球，其特征在于：所述MSCs选自人脐带间充质干细胞第2~4代。

5.根据权利要求1所述的负载MSCs来源外泌体的口服微球，其特征在于：所制备的负载MSCs外泌体的微球外壳尺寸为241±8.1 µm，内核尺寸大小为126±3.8μm。