[发明专利]枳抗寒基因PtrBADH及其在植物抗寒遗传改良中的应用

说明书

本发明公开了一种枳抗寒基因PtrBADH及其在植物抗寒遗传改良中的应用，PtrBADH基因为一种从极抗寒枳(Poncirus trifoliata)中分离、克隆出的一个甜菜碱合成关键基因，命名为PtrBADH，其序列为SEQ ID NO.1所示。将该基因构建超表达和RNAi载体，并通过农杆菌介导的遗传转化将其分别导入烟草、柠檬和枳中，获得的转基因植株经生物学功能验证，结果表明PtrBADH基因具有提高植物抗寒性的功能。该基因的发现，为植物抗逆分子设计育种提供新的基因资源，为实施绿色农业、节水农业提供新的遗传资源，该遗传资源的开发利用有利于降低农业生产成本和实现环境友好。

技术领域

本发明属于植物基因工程领域。具体涉及从枳(Poncirus trifoliata)中分离、克隆得到一个甜菜碱合成关键基因PtrBADH，还涉及该基因在植物抗寒遗传改良中的应用，将该基因在烟草、柠檬和枳中超表达，获得的转基因植物抗寒性明显提高。

背景技术

在整个生长发育过程中，植物经常遭受各种环境的挑战，例如，病虫害等生物胁迫以及温度、干旱、盐碱等非生物胁迫。由于植物不能像动物一样可以通过自我的移动来规避不利影响，因此，植物在遭受不利因素胁迫时，其自身会做出一系列分子、细胞和生理水平的变化，来抵御不利影响。

低温作为影响植物生存的主要的胁迫之一，经常造成农业的重大灾害。对于提高作物的抵御寒冷的能力，已成为广大研究人员的关注热点。低温胁迫通过影响植物的生长，发育和存活来限制植物的地理分布和农业产量。大多数温带植物，包括拟南芥，可以通过冷驯化而获得抗冻性(Zhu.,2007)，植物抵御低温胁迫主要通过自身生理及转录水平的改变。在许多温带植物，例如冬小麦，大麦，燕麦和油菜中都有冷驯化的迹象(Chinnusamy etal.,2007)。在植物处于低温环境中时，有关基因受到诱导表达量发生变化，从而调控植物对低温胁迫的抵御能力，这些基因既包括调控基因又包括功能基因。例如，Guy和其同事(1985)首次描述了低温调控基因(cold-regulated(COR)genes)在低温胁迫下存在功能。在拟南芥中CORs包括COR、低温诱导基因(LTI)、脱水应答基因(RD)和早期脱水诱导基因(ERD)。这些基因中存在一些编码渗透酶生物合成的关键酶，这些酶可通过防冻蛋白和可溶性糖的积累来提高冷冻耐受性。CBF转录因子作为脱水反应元件(DRE)结合因子1(DREB1)蛋白，对于高等植物的冷驯化至关重要(Liu et al.,1998；Jaglo-Ottosen and K.R..,1998)。在长期的进化过程中，植物己经形成了高效且复杂的抵御低温伤害的应答机制，即在分子、细胞和生理水平上做出一系列的调整，从而减少低温对植物造成的伤害(Nakashima et a1.,2009)。

甜菜碱((glycine betaine,GB)是维持细胞稳定的重要渗透调节物质。在逆境条件下，植物体内大量积累甜菜碱，以降低渗透胁迫对细胞膜的损伤，保护三梭酸循环的主要酶活性以及稳定光合作用中多肤的功能等(梁峥，骆爱玲.1995)，从而提高植物适应不良环境的能力。1975年，Storey等首次在植物中观察到盐分胁迫引起甜菜碱积累的现象。在高等植物叶，甜菜碱的合成在叶绿体中，胆碱经过两次酶催化反应(CMO和BADH)催化生成(Sakamoto et al.,1998)。甜菜碱醛脱氢酶(BADH)作为甜菜碱合成关键酶，调控甜菜碱合成与代谢的动态平衡(Fujiwara et al.,2008；Kopecny et al.,2011)。当植物受到干旱与盐碱胁迫时其酶活力显著提高，从而显著增加甜菜碱的积累(Arakawa et al.,1987)。已有研究人员将甜菜碱醛脱氢酶基因导入到玉米植株体内并验证在相同条件下，转badh基因植株抗旱性优于非转基因受体(王小丽等，2014；韩猛等2015，刘晓璐，2016)。

枳是柑橘产业中应用较为广泛的一种砧木，极抗寒，是研究木本植物抗寒性及克隆有关抗寒基因克隆问题的理想材料。因此，克隆枳抗寒有关基因是抗寒基因工程的关键和基础。

发明内容