[发明专利]养颜护肤干细胞因子纳米脂质体制剂制备方法

权利要求书

1.养颜护肤干细胞因子纳米脂质体制剂制备方法，其特征在于，包括以下步骤：

S1：间充质干细胞复苏与培养；在离心管中加入间充质干细胞培养基，将保存干细胞的冻存管投入水浴中，平摇直至细胞完全融化，再将细胞悬浮液缓慢逐滴至离心管中，一次离心后吸掉上清液，使用间充质干细胞培养基重悬细胞，将细胞悬浮液缓慢移至预先加入间充质干细胞培养基的培养瓶中，放于增养箱内，进行传代培养，酶消化后将细胞悬液全部移至离心管中，二次离心后收集上清液；

S2：细胞因子制备；将S1中收集的上清液，无菌分装高速离心管，三次离心后收集上清液，再将上清液转入30KD超滤管，四次离心后取滤出液，再将透析液通过1KD超滤膜，收集截留液，得到细胞因子浓缩液；

S3：脂质体制备；称取大豆卵磷脂和胆固醇，加乙醇并加热，充分溶解后移入烧瓶中，55℃减压旋转蒸发，使磷脂膜均匀覆盖在烧瓶侧壁，并使乙醇溶剂完全挥发，将生物蛋白包裹在脂质体中，采用微射流法，使脂质体粒径均匀，溶液逐渐变微蓝，再整粒除菌，将制得的细胞因子浓缩液加入去离子水或磷酸盐水溶液中，不断旋转振摇下摇匀得水溶液II，再将水溶液II加入烧瓶中，不断旋转振摇下得到脂质体乳液，使脂质薄膜充分水化，直至乳液变为透明，过0.22um滤膜，得到载干细胞因子的脂质体制剂。

2.根据权利要求1所述的养颜护肤干细胞因子纳米脂质体制剂制备方法，其特征在于，所述S1中，水浴为37℃水浴，间充质干细胞培养基为DMEM/F12无血清人脐带间充质干细胞培养基。

3.根据权利要求1所述的养颜护肤干细胞因子纳米脂质体制剂制备方法，其特征在于，所述S1中，一次离心的具体步骤为：室温下300xg离心5min，二次离心的具体步骤为：无菌级操作间高速离心机4℃下1800xg离心8min。

4.根据权利要求1所述的养颜护肤干细胞因子纳米脂质体制剂制备方法，其特征在于，所述S1中，增养箱条件为37℃、5％二氧化碳。

5.根据权利要求1所述的养颜护肤干细胞因子纳米脂质体制剂制备方法，其特征在于，所述S1中，传代培养的具体步骤为：72h后换液，以后每隔48h换液一次，细胞长满至80％-90％，消化细胞，进行传代培养，选择P5代处于对数生长期的细胞。

6.根据权利要求1所述的养颜护肤干细胞因子纳米脂质体制剂制备方法，其特征在于，所述S2中，三次离心的具体步骤为：无菌级操作间高速离心机4℃下6000xg离心30min，四次离心的具体步骤为：无菌级操作间高速离心机5000g离心30min。

7.根据权利要求1所述的养颜护肤干细胞因子纳米脂质体制剂制备方法，其特征在于，所述S3中，加乙醇并加热至55℃超声，将生物蛋白包裹在脂质体中的具体步骤为：常压下，加一定比例的生理盐水或20mMPBS溶液，通过旋转洗膜至水合完全，并4℃孵育过夜。

8.根据权利要求1所述的养颜护肤干细胞因子纳米脂质体制剂制备方法，其特征在于，所述S3中，微射流法的具体步骤为：开始时控制压力为50-60MPa，第2次开始，压力增加至120MPa，反复操作使脂质体粒径均匀。

9.根据权利要求1所述的养颜护肤干细胞因子纳米脂质体制剂制备方法，其特征在于，所述S3中，整粒除菌的具体步骤为：依次通过0.45μm和0.22μm滤膜，细胞因子浓缩液和去离子水的比例为1：5，磷酸盐水溶液的PH为6.8。

10.根据权利要求1所述的养颜护肤干细胞因子纳米脂质体制剂制备方法，其特征在于，所述S3中，旋转振摇在水溶旋转蒸发仪上进行，使脂质薄膜充分水化的具体步骤为：探式超声仪在冰水浴条件下使脂质薄膜充分水化20-120min。