[发明专利]一种内切型β-甘露聚糖水解酶Man01929及其突变成糖基转移酶的方法及应用

说明书

本发明涉及一种内切型β‑甘露聚糖水解酶Man01929及其突变成糖基转移酶的方法及应用，内切型β‑甘露聚糖酶Man01929的氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示；编码Man01929的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示。本发明对该酶进行定点突变，结果显示氨基酸序列的第118、119、124、323位点在Man01929对半乳甘露聚糖的识别、结合与降解等底物选择性作用过程中扮演了重要角色。这对促进GH5家族β‑甘露聚糖酶底物选择性机制的研究具有参考价值。另外，本发明还获得了具有转糖基能力的突变体D124Y，为揭示水解酶转变成糖基转移酶的催化机制的转换机理提供了重要参考。

技术领域

本发明涉及一种内切型β-甘露聚糖水解酶Man01929及其突变成糖基转移酶的方法及应用，属于生物技术领域，涉及蛋白质改进技术。

背景技术

甘露聚糖是一类具有复杂结构的多糖，根据糖单元组成结构的不同，可分为四类：纯甘露聚糖(pure mannan)、葡甘聚糖(glucomannan)、半乳甘露聚糖(galactomannan)以及半乳葡甘聚糖(galactoglucomannan)。甘露聚糖因结构复杂，故彻底水解时需要多种酶的协同作用，如β-甘露聚糖酶(EC 3.2.1.78)、β-甘露糖苷酶(EC 3.2.1.25)、β-葡萄糖苷酶(EC3.2.1.21)、乙酰甘露聚糖酯酶(EC 3.1.1.6)、α-半乳糖苷酶(EC 3.2.1.22)。β-甘露聚糖酶是一类糖基水解酶(Glycoside Hydrolase,GH)，在水解过程中起关键作用，它可以水解甘露聚糖主链内部的β-1,4糖苷键，产生甘露寡糖片段。甘露寡糖是由2-10个糖单元通过糖苷键链接而成的，具有多种生理活性，如抗肿瘤、调节免疫力、促进细胞分裂等。与化学方降解法相比，酶法降解甘露多糖制备寡糖的策略具有反应条件温和而可控性强，底物选择性清晰而产物明确等优势，因此β-甘露聚糖酶具有推广应用的潜质。随着研究的深入，β-甘露聚糖酶在食品、养殖业、洗涤剂行业、生物乙醇和石油钻探等各个领域的应用越来越广泛。

目前，虽然关于β-甘露聚糖酶的专利申请及科研文献数量较多，但主要集中在(1)β-甘露聚糖酶的产酶菌株及酶资源发掘；(2)优化异源表达的条件，从而提高酶的表达水平以应用于生产；(3)通过分子截短、定点突变以及构建糖基化修饰位点的手段，提高酶的催化效率、底物特异性、热稳定性以及耐酸碱的特性等。现有的研究仍然存在以下不足：

(1)β-甘露聚糖酶的底物选择性及其识别机制不明确。作为工具酶，既需要明确的底物选择性，也需要明确的底物选择机制，然而现有研究关于决定酶底物选择性的因素研究较少。这可能是由于两方面的原因造成的：第一，甘露聚糖底物中各种糖单元的大小或结构高度相似，给酶对底物的专一性识别、降解造成困难，大多数甘露聚糖酶具有底物广谱性恰恰是例证。第二，β-甘露聚糖酶本身具有柔性结构，可以识别、结合多种底物，但究竟是哪些糖基结合位点具体参与了底物的选择性识别与作用过程等机理研究甚少。仅少数文献报道了GH5家族β-甘露聚糖酶的-1亚位点和GH26家族β-甘露聚糖酶-2亚位点氨基酸残基参与半乳甘露聚糖的识别，是否存在其它类型活性位点残基也参与了酶对半乳甘露聚糖的识别与降解，未见报道。

(2)部分天然β-甘露聚糖酶，如GH5、GH113家族成员，既具有糖基水解酶的活性又有糖基转移酶的活性，这也对用于降解多糖制备寡糖的专一性工具酶的开发造成困难，需要了解同一个酶进行糖基水解酶、糖基转移酶两种催化机制转换调节的机理。