[发明专利]一种靶向p53蛋白的寡核苷酸序列及其衍生探针和应用

说明书

一种靶向p53蛋白的寡核苷酸序列及其衍生探针和应用。所述寡核苷酸的序列为：TGGCGGAGGGGCGGTAGGGG，该序列可特异性结合于p53蛋白，结合常数kd值为2.43E‑08M，具有较高的灵敏度和选择性。衍生探针包括Cy5‑sDNAp53、Biotin‑sDNAp53和FAM‑sDNAp53，是将花青素Cy5荧光素、生物素和5(6)‑羧基荧光素三种探针分子分别连在sDNAp53的5’端所制备而成。其中Biotin‑sDNAp53可用于p53蛋白的富集；FAM‑sDNAp53可用于p53蛋白的荧光偏振分析；Cy5‑sDNAp53可用于p53蛋白的定位等分析。与传统的p53抗体检测相比，基于sDNAp53寡核苷酸序列衍生的探针使用方便，检测灵敏度高，能够准确分析细胞和组织中的p53蛋白，可用于临床诊断和癌症早期发现。

技术领域

本发明属于靶蛋白的检测、富集和功能评价技术领域，涉及一种靶向p53蛋白的高亲和力寡核苷酸序列及其衍生化探针的应用。

背景技术

p53(TP53)是一种重要的抑癌基因，它控制着细胞周期的启动，阻止DNA损伤，修复受损DNA，对细胞增殖分化起着监视作用。在细胞周期、凋亡和DNA损伤修复中起着重要的作用。因此对p53蛋白的快速精准的检测及功能评价一直是癌症研究的热点之一。目前对于p53分析检测研究的方法有很多，包括多种免疫分析方法，电子介导的酶促电化学检测方法，基于纳米粒子放大技术的生物传感方法及荧光检测方法等。例如，传统的竞争性ELISA检测方法，其原理是利用辣根过氧化酶(HRP)标记p53蛋白单克隆抗体，通过标记抗体与重组p53蛋白的竞争，建立竞争性ELISA检测方法；中国专利(CN201410724706.2)公开了一种p53蛋白的电化学免疫检测方法，其所述检测方法通过三明治免疫反应检测p53蛋白；中国专利(CN201510004601.4)还公开了基于纳米粒子放大技术检测p53蛋白的生物传感器，其所述特征是利用抗原与抗体的特异性免疫反应对野生型p53蛋白进行特异性识别，通过纳米粒子的信号放大，实现对p53蛋白的检测。

然而目前所报道的检测方法基本原理多以针对p53蛋白抗原表位的免疫反应为基础，较高的成本以及繁琐的操作步骤也限制了其使用。此外，研究发现在超过50％以上的人类恶性肿瘤中p53的功能会发生变化。利用p53蛋白特异性的DNA结合口袋可以特异性结合DNA的特性，可设计替代传统抗体的新型探针来实现对p53蛋白的功能性检测。例如，中国专利(CN201710885397.0)公开了一种p53蛋白的荧光检测方法，其特征为利用磁性纳米粒包覆的特定的DNA片段(简称，CN2017)结合p53蛋白，并通过荧光法检测细胞裂解液中的p53蛋白，其所述DNA序列CN2017和p53蛋白的结合能力较低，因此检测的特异性和灵敏度有待提高。

发明内容

本发明目的是解决现有探针检测p53蛋白的特异性和灵敏度较低以及应用具有局限性的问题。为了特异、高灵敏度和高效的检测p53蛋白，本发明设计合成了一种新的靶向p53蛋白的寡核苷酸序列，及其三种衍生探针和应用。

本发明的技术方案

一种靶向p53蛋白的寡核苷酸序列，由20个核苷酸组成：TGGCGGAGGGGCGGTAGGGG，简称sDNAp53。

该sDNAp53寡核苷酸序列可特异性结合p53蛋白，经表面等离子共振技术(SPR)测定其与p53蛋白的结合常数kd值为2.43E-08M，具有较高的灵敏度和选择性。

本发明同时提供了由sDNAp53衍生的三种探针，所述衍生探针是分别在sDNAp53的5’端共价结合不同的检测和捕获用的探针分子，包括花青素Cy5荧光素(简称Cy5)、生物素(简称Biotin)和5(6)-羧基荧光素(简称FAN)，并分别制备成三种不同用途的寡核苷酸探，Cy5-sDNAp53探针，Biotin-sDNAp53探针和FAM-sDNAp53探针。