[发明专利]一种轴突型腓骨肌萎缩症果蝇模型的构建方法及应用

说明书

本发明涉及一种模拟人类疾病的果蝇模型构建方法与应用，具体涉及一种轴突型腓骨肌萎缩症（CMT2）的果蝇模型的构建方法及应用。该模型通过基因组编辑手段构建果蝇内源对应人源ATP1A1基因的氨基酸突变，利用脑部神经系统回路、生物钟相关行为、寿命、运动能力的变化评估病理表型。通过本发明建立的模型和病理评估手段，具有操作简单，可重复性强的优点，获得的CMT2果蝇模型可用于研究该病的病理进程及机制，也可用于大规模筛选验证延缓或治疗CMT2疾病的药物，具有很好的应用前景。

技术领域

本发明属于生物技术领域，具体涉及一种轴突型腓骨肌萎缩症（CMT2）的果蝇模型的构建方法及应用。

背景技术

腓骨肌萎缩症（Charcot-Marie-Tooth，CMT）早在1886年被发现，又称为遗传性运动感觉神经病（HMSN）。CMT是遗传性外周神经系统疾病，以外围神经系统缺陷为特征，包括感觉和运动神经元的缺陷，常表现为肌肉组织和身体各部位的触觉进行性丧失。临床主要特征是四肢远端进行性的肌无力和萎缩伴感觉障碍。CMT的发病率约为1/2500，是最常见的遗传性外周神经病之一。根据临床和电生理特征，CMT分为原发性脱髓鞘性神经病（CMT1，CMT3和CMT4）和原发性轴突神经病（CMT2），多数呈常染色体显性遗传，也可呈常染色体隐性或X-连锁遗传。

CMT病通常是由神经元中某些蛋白质缺陷的突变引起的。神经信号由轴突传导，髓鞘包裹在其周围。CMT中的大多数突变影响髓鞘，比如常见的17号染色体短臂上包含基因PMP22的大区域的重复。有些突变影响轴突，比如影响编码线粒体蛋白的基因MFN2。细胞在其细胞核和线粒体中含有单独的基因组。在神经细胞中，线粒体沿长轴突传播。在某些形式的CMT中，突变的MFN2导致线粒体形成大的簇或凝块，其不能沿着轴突向突触移动。这可以防止突触发挥作用。至今为止，发现至少50个基因突变引起CMT。但是，直接利用患病的人类个体进行研究存在很大的局限性，所以用模型生物研究这些基因的功能显得尤其重要。

人类疾病的动物模型早已应用于医疗，制药等领域，并日渐展现出不可被替代的优势。黑腹果蝇(Drosophila melanogaster)是生物学研究中最重要的模式昆虫之一，它在遗传的染色体理论建立中起到非常重要的作用。同时，人类基因组中含有2~3万个基因，超过 60%的人源基因在果蝇中能找到其同源基因，这使得果蝇能成为研究人类疾病的重要模式生物。至今为止，研究发现50多个引起CMT的基因突变超过35个在果蝇中存在其同源基因。Na⁺-K⁺-ATPase是一种蛋白离子泵，负责对质膜上钠钾离子转运活性的反应，维持细胞内钠钾离子平衡。人类ATP1A1编码Na⁺-K⁺-ATPase的α1亚基，在几乎所有组织中广泛表达，最近我们和其它人的研究同时揭示ATP1A1突变能引发CMT2。但是，至今还没有合适的模拟ATP1A1突变动物模型可用于该疾病机制的研究和相关药物的筛选。果蝇中的人类ATP1A1同源基因为Atpα，氨基酸水平具有高度的同源性。因此，本发明公布了一对优化的基于CRISPR/Cas9基因组编辑技术的打靶位点，同时公布了一组构建供体DNA的引物和一组鉴定基因编辑成功的引物。基于本发明公布的引物序列及操作方法，能够高效构建Atpα跨膜区特定氨基酸突变的果蝇，模拟人类轴突型腓骨肌萎缩症（CMT2）。同时，我们建立了利用脑部钟神经系统回路和生物钟相关行为、寿命、运动能力的变化评估病理表型的方法。通过本发明建立的模型和病理评估手段，具有操作简单，可重复性强的优点，该Atpα突变的CMT2果蝇模型可用于研究该病的病理进程及机制，也可用于大规模筛选延缓或治疗该疾病的药物，具有很好的应用前景。

发明内容

本发明所要解决的技术问题是建立Atpα突变的CMT2果蝇模型，并提供一种轴突型腓骨肌萎缩症（CMT2）的果蝇模型的构建方法及应用。

为了解决上述技术问题，本发明采用了如下技术方案：