[发明专利]高产L-赖氨酸的谷氨酸棒状杆菌及其应用

说明书

本发明公开了来源于谷氨酸棒状杆菌的突变的二氨基庚二酸脱氢酶及编码其的核苷酸序列、含有该核苷酸序列的表达载体、含有该表达载体的表达系统，以及所述突变的二氨基庚二酸脱氢酶及编码其的核苷酸序列、所述表达载体和所述表达系统在生产L‑赖氨酸中的应用及生产方法。本发明含有突变的二氨基庚二酸脱氢酶的谷氨酸棒状杆菌生产L‑赖氨酸的产率高。

技术领域

本发明属于生物技术领域，具体地说，涉及一种突变的二氨基庚二酸脱氢酶及其在生产L-赖氨酸中的应用。

背景技术

赖氨酸(lysine)，化学名称为2,6-二氨基己酸，性状为白色或近白色结晶性粉末，几乎无臭。赖氨酸有L-型、D-型和DL-型3种旋光异构体，然而可供人类和动物吸收利用的只有L-型赖氨酸。

L-赖氨酸广泛应用于饲料、食品及医药工业中。目前，90％以上的L-赖氨酸产品可用于饲料添加剂。用于制备L-赖氨酸的方法主要有三种：微生物发酵法、蛋白水解抽提法和化学合成与酶法。微生物发酵L-赖氨酸又可分为前体发酵法和直接发酵法。其中，前体发酵法是以二氨基庚二酸(DAP)为底物，借助微生物或酶转化为L-赖氨酸；直接发酵法是指利用具有合成L-赖氨酸能力的微生物，通过生物合成途径将碳水化合物转化为L-赖氨酸。

工业生产中，用来发酵生产L-赖氨酸的细菌主要是棒杆菌属的杆状细菌和埃希氏菌属的大肠杆菌。这些细菌的获得，一方面可以从自然界分离得到，另一方面也可以通过诱变或基因工程改造的方法得到，或者两者兼而有之。

现有文献中已有关于对二氨基庚二酸脱氢酶的编码基因ddh改造的相关报道。但主要都是通过对基因ddh进行强启动子的替换，或增加其在菌体中的拷贝数，以此来提高基因ddh在菌体中的表达量，进而提高L-赖氨酸的产量。例如，WO2009096690、WO2009014117、CN106318964B、CN101824392B等。

因此，需要对基因ddh编码区核苷酸序列进行位点突变，开发新的谷氨酸棒状杆菌菌株，以期提高生产L-赖氨酸的量。

发明内容

为了实现本发明目的，本发明提供一种突变的二氨基庚二酸脱氢酶及其应用。

第一方面，本发明提供一种突变的二氨基庚二酸脱氢酶，相对于野生型，突变的氨基酸位点选自以下中的一个或几个：F47Y(第47位苯丙氨酸变为酪氨酸)、P73L(第73位脯氨酸变为亮氨酸)、L114V(第114位亮氨酸变为缬氨酸)、Y130H(第130位酪氨酸变为组氨酸)、I159L(第159位异亮氨酸变为亮氨酸)。

作为一个具体的实施方案，野生型二氨基庚二酸脱氢酶的氨基酸序列如SEQ IDNO.9所示；编码所述野生型二氨基庚二酸脱氢酶的核苷酸序列如SEQ ID NO.7所示。

作为一个具体的实施方案，突变的二氨基庚二酸脱氢酶为：(1)：由SEQ ID NO.10所示的氨基酸序列组成；或(2)：在(1)中的氨基酸序列经过取代、缺失或添加一个或几个氨基酸且具有同等功能的由(1)衍生的氨基酸序列。

第二方面，本发明提供一种编码所述突变的二氨基庚二酸脱氢酶的核苷酸序列。

作为一个具体的实施方案，编码所述突变的二氨基庚二酸脱氢酶的核苷酸序列为：(1)由SEQ ID NO.8所示的核苷酸序列组成；或(2)：与(1)的核苷酸序列互补的序列；或(3)：与(1)的核苷酸序列具有95％以上同源性的序列。

第三方面，本发明提供一种表达载体，所述表达载体含有编码所述突变的二氨基庚二酸脱氢酶的核苷酸序列。

第四方面，本发明提供一种表达系统，所述表达系统含有所述的表达载体。

作为一个具体的实施方案，所述表达系统是能够产生L-赖氨酸的表达系统；优选地，所述表达系统为谷氨酸棒状杆菌。