[发明专利]葡萄早熟相关GDSL型酯酶/脂肪酶标志基因

权利要求书

1.葡萄早熟相关GDSL型酯酶/脂肪酶标志基因在H₂O₂促葡萄早熟中的应用，其特征在于，包括如下步骤：

S1、选取对照组：选取自然生长的“峰早”葡萄和利用蒸馏水处理后的“巨峰”葡萄；

S2、实验组处理：将300mmol/L的H₂O₂均匀喷涂在“巨峰”葡萄上，其中，第一次喷施为开花后25天，第二次为开花后35天，每个过程重复三次，每次重复五棵树；

S3、收集材料：每次采样从上午9点开始，用锡纸包起来，立即放入液氮罐中；

S4、采集样本：每棵树随机抽取30个样本，记录果实发育的物候期数据；

S5、葡萄中GDSL型酯酶/脂肪酶基因家族鉴定；

S6、多序列比对和系统发育分析；

S7、葡萄中GELP基因的表达分析；

S8、RNA提取和实时荧光定量；

S9、与葡萄果实发育相关的候选VvGELP基因的筛选：

（1）采用TIANGEN试剂盒提取“巨峰”葡萄和“峰早”葡萄的果实总RNA；

（2）回收PCR产物；

（3）构建载体并与目的基因连接，将重组后的载体质粒转入大肠杆菌；

（4）利用ExPASy在线分析工具对VvGELP76基因编码的蛋白质进行氨基酸基本性质分析；

所述S5中，从Pfam网站中，下载GDSL型酯酶/脂肪酶结构域序列，利用隐马尔可夫模型软件HMMER进行比对搜索葡萄中的GELP基因，将得到的GELP基因蛋白序列用Clustalx进行比对建立新的HMM文件，然后利用HMMER软件搜索葡萄中GELP基因，将得到的基因提交到SMART和CDD网站进行结构认证，保留其中含有GELP保守结构域的基因，数据处理中去掉重复基因以及基因中包含“N”的个数大于全长的30%的基因，并保留同一基因不同可变剪切中最长的氨基酸序列；葡萄基因组序列从EnsemblePlants数据库下载；利用ExPASy在线分析工具对葡萄GELP基因编码的蛋白质进行氨基酸基本性质分析；

所述S6中，用鉴定出的VvGELP基因蛋白序列与23个其他物种功能已知的GELP基因蛋白序列在MEGA7.0中构建系统发育树，并将参数设置为：homogeneous pattern；pairwisedeletion；bootstrap值1000；23个功能已知的GELP蛋白序列从UniProt数据库下载；

所述S7中，VvGELP基因的FPKM值来自RNA-seq数据，数据处理过程：计算每次生物学重复平均FPKM值，并取值log₁₀，利用软件R将数据可视化；

S8中，用多糖多酚植物总RNA提取试剂盒对H₂O₂处理和对照的“巨峰”以及未处理“峰早”果实提取RNA，随后用TaKaRa反转录试剂盒，反转录合成cDNA，作为模板用于PCR扩增，PCR扩增的引物为：

Gene name	Gene ID		Sequence (5'-3')	product
VvGELP3]]>	VIT_01s0137g00710	Forward	GGATACACAACACAGGTCCC	163
		Reverse	TGCTTTCTGAGTTCCACCAC
VvGELP5]]>	VIT_01s0137g00730	Forward	GTGAAGTACCGCCTCATCAG	190
		Reverse	CATCCCAGCTAATCCGAACC
VvGELP12]]>	VIT_05s0020g04840	Forward	TGGAGTGGTCTGTGATCCTT	85
		Reverse	CTCATTCACCCTCACTGCTC
VvGELP25]]>	VIT_09s0002g00490	Forward	ACGATTACATGAGCCCGTTC	83
		Reverse	GCCAATCACCATACCGACAT
VvGELP29]]>	VIT_09s0002g00530	Forward	GCATTTCCATCCAGAAGCAT	102
		Reverse	AATTTGCCCGTTGATCAGTG
VvGELP30]]>	VIT_09s0002g00540	Forward	TGGAGGCAATGACTACATAAGC	158
		Reverse	CCATGTTCACGAACCCAAAT
VvGELP36]]>	VIT_10s0003g00600	Forward	AGAGTTTATGGGACCAAGGTG	126
		Reverse	GCTCTTCTATACAGCCTCGTT
VvGELP43]]>	VIT_10s0003g02120	Forward	TCTTCCTTTCCAGACTCCATG	145
		Reverse	GCGAATATCAATGGGGTAAGC
VvGELP48]]>	VIT_13s0106g00250	Forward	CCGTGGAAAAGCTGAACAAC	94
		Reverse	CTCGCTTGCTTCTTCAATGC
VvGELP62]]>	VIT_14s0083g00850	Forward	ACTCCTCTCTCAACAACTCAC	168
		Reverse	TATACGGACACTAGGCTGTTG
VvGELP67]]>	VIT_15s0046g01450	Forward	CTCCTGCCAAACACTTCCTT	164
		Reverse	AACGTGTAGAGGGATTTCGC
VvGELP70]]>	VIT_17s0000g10060	Forward	AGGCTAGTGATCGACTTTGTTG	185
		Reverse	TGAGTTTGGATTGACTGAGGAG
VvGELP76]]>	VIT_18s0001g14800	Forward	TCCGGGCAATAACAACAATC	127
		Reverse	GGCAATGAAGTCAGACGGAAT
VvGELP82]]>	VIT_19s0090g00660	Forward	AACGCTGCTGATTTTCTTGC	141
		Reverse	ATCAAAGATTCCGGCACCTC

根据S6和S8筛选出VvGELP76为参与葡萄果实发育成熟的候选基因；

在采用TIANGEN试剂盒提取“巨峰”葡萄和“峰早”葡萄的果实总RNA中，以总RNA为模版，反转录合成cDNA，利用Primer3设计特异性引物，克隆VvGELP76基因全长的引物序列为：VvGELP76 Forward：AACTGTGGTCGTCTTCTCG，VvGELP76 Reverse：CCACGCATTTCTGGATGATC，以反转录生成的cDNA为模板进行PCR扩增，反应程序为：95℃预变性3 min；95℃ 20 s，58℃30 s，72℃ 30 s，35个循环；最后，72℃延伸5 min。