[发明专利]一种葡萄果实早熟标志基因

说明书

本发明公开了一种葡萄果实早熟标志基因，步骤一、选取对照组：选取自然生长6年的巨峰葡萄用含0.03％wet‑77表面活性剂的水处理；步骤二、试验组处理：在两组对照组葡萄上喷涂300mmol/L的过氧化氢，其中第一次喷施时间为开花后25天，第二次喷施时间为35天，开花后35天，每隔10天取样一次；本发明通过利用生物信息学和分子生物学方法鉴定并分离葡萄小分子热激蛋白的基因序列，从而达到对葡萄HSP20基因家族进行分析，并结合实时荧光定量PCR筛选出与葡萄成熟发育相关家族成员，进一步克隆出峰早与巨峰的HSP20基因的序列，为关于HSP20在为植物生长发育和响应环境胁迫提供坚实的基础。

技术领域

本发明涉及生物技术领域，具体为一种葡萄果实早熟标志基因。

背景技术

热激蛋白(heat shock protein，HSP)是指生物体在遭受高温、干旱、渗透、盐害等胁迫刺激后，大量表达或者新合成的一系列蛋白质。葡萄(学名：Vitis vinifera L.)为葡萄科葡萄属木质藤本植物，小枝圆柱形，有纵棱纹，无毛或被稀疏柔毛，叶卵圆形，圆锥花序密集或疏散，基部分枝发达，果实球形或椭圆形，花期4-5月，果期8-9月。葡萄是世界最古老的果树树种之一，葡萄为著名水果，生食或制葡萄干，并酿酒，酿酒后的酒脚可提酒食酸，根和藤药用能止呕、安胎。

葡萄浆果风味佳，是人们最喜爱的水果之一。随着人们生活水平的提高，早熟葡萄越来越受到消费者的青睐，“峰早”是在河南洛阳发现一种新的早熟葡萄品种，且“峰早”比常见的“巨峰”提前成熟了大概一个月。

发明内容

本发明的目的在于提供一种葡萄果实早熟标志基因，本发明通过利用生物信息学和分子生物学方法鉴定并分离葡萄小分子热激蛋白(shsp/HSP20) 的基因序列，从而达到对葡萄HSP20基因家族进行分析，并结合实时荧光定量PCR(qRT-PCR)筛选出与葡萄成熟发育相关家族成员，进一步克隆出“峰早”与“巨峰”的HSP20s基因的序列，为关于HSP20在为植物生长发育和响应环境胁迫提供坚实的基础。

为实现上述目的，本发明提供如下技术方案：一种葡萄果实早熟标志基因，包括如下步骤：

步骤一、选取对照组：选取自然生长6年的“巨峰”葡萄和经过蒸馏水(含 0.03％wet-77表面活性剂)处理的“巨峰”葡萄；

步骤二、试验组处理：在两组对照组葡萄上喷涂300mmol/L的H₂O₂，其中第一次喷施时间为开花后25天，第二次喷施时间为35天，开花后35天，每隔10天取样一次，直到处理后的果实成熟；

步骤三、葡萄小热激蛋白家族成员的鉴定：

(7)从数据库Ensembl Plants Database中下载葡萄基因组，然后获取 HSP20保守结构域的隐马尔可夫模型，进行VvHSP20家族成员的确定，留下分子量在15–42kDa之间的成员，并将这些序列提交到CDD,Pfam和SMART进行结构域认证；

(8)葡萄HSP20的家族成员系统进化分析；

(9)基于RNA-Seq数据对葡萄HSP20基因家族成员进行表达分析；

(10)葡萄HSP20基因实时荧光定量(qRT-PCR)分析；

(11)葡萄成熟相关基因VvHSP20全长cDNA分离；

(12)得出结论：确定VvHSP20家族有48个成员，结合系统发育分析和转录组数据分析，挑选出与葡萄成熟相关基因HSP20-39，在成熟过程中，在自然生长的巨峰葡萄和处理的巨峰葡萄，HSP20-39的表达存在显著差异。