[发明专利]一种利用FACT Ⅲ微载体体外扩增精原干细胞的三维动态培养方法

说明书

本发明提供了一种利用FACT Ⅲ微载体体外扩增精原干细胞的三维动态培养方法。该方法利用转壁氏生物反应器（RCCS）构建三维动态培养环境，选择FACTⅢ微载体为支架材料，建立了能支持小鼠睾丸SSCs体外快速增殖和维持其未分化特性的三维动态培养体系。该三维动态培养体系下，SSCs在RCCS中培养一周后，表现出极优的增殖效果，尤其在体外培养17‑22d获得SSCs得到快速增殖，增殖的SSCs细胞仍保留着其未分化状态的生物学特性和功能。本发明方法具有操作简单，培养成本低，重复性好，培养成功率高，无需传代，可避免饲养层细胞污染等明显优势，提供了一种可靠的SSC体外培养技术方案。

技术领域

本发明属于生物技术领域，具体涉及一种利用FACT Ⅲ微载体体外扩增精原干细胞的三维动态培养方法。

背景技术

精原干细胞（spermatogonial stem cells，SSCs）是位于睾丸曲精细管基膜处的雄性生殖系干细胞，具有维持自我更新和定向精子分化潜能的成体干细胞，在体外培养过程中也可以自发的去分化转变成为多能干细胞，成为干细胞机制研究和再生医学临床应用的理想种子细胞。

人和动物体内的成体干细胞数量非常少，成年小鼠睾丸中SSCs占所有生殖细胞的0.03%，将成体干细胞应用到临床医学，迫切需要解决的问题就是如何在体外大规模扩增这些干细胞，足够的干细胞的数量和质量才能达到临床治疗的要求。然而，目前SSCs通常采用的二维平面培养的方法，也就是传统的贴壁式培养，这种培养方法成本高（如已经报道建系使用的Stempro-34 SFM无血清培养体系）、需要添加饲养层细胞、SSCs细胞生长缓慢，容易造成自然分化，尤其是目前在很多物种中还未建立起有效的体外增殖方案，而且这种SSCs呈贴壁状态生长，因为其有限的表面积不能支持SSCs长期生长，面临着细胞增殖缓慢，真正可用未分化SSCs细胞数量非常少等诸如的技术瓶颈。因此，体外快速大规模扩增获得功能性SSCs仍是亟待解决的关键技术问题，三维培养是更接近机体环境的一种培养方式，是目前工艺生产广泛应用的技术。

由生物反应器提供的三维动态培养环境，已成功的应用于胚胎干细胞（embryonicstem cells, ESCs）和诱导多潜能干细胞（induced pluripotent stem cells, iPSCs）的增殖和分化培养，可显著地增强干细胞增殖和分化的能力，提高干细胞培养效率，进而促使干细胞的研究和应用更加标准化。然而，SSCs作为生殖系的成体干细胞，三维动态培养环境下的增殖培养是否能为SSCs生物学研究以及临床上雄性不育和再生医学提供可替代的培养方案，有待开发。

微载体培养技术是目前进行规模化扩增的一种有效方法，其极大的比表面积在很小的空间里贴附更多的细胞，从而可以培养出大量的细胞满足组织工程的细胞数量的要求。将三维动态培养和微载体培养技术相结合，这种培养方式避免了传统二维平面常规方法的缺点，如培养多次消化传代、操作繁琐和耗时长等。

发明内容

本发明的目的是提供一种利用FACT Ⅲ微载体体外扩增精原干细胞的三维动态培养方法。

本发明通过大量相关试验，最终筛选出精原干细胞（SSCs）可在转壁式细胞培养系统（rotary cell culture system, RCCS）中的高效生长的生物支架材料（FACTⅢ微载体），支持SSCs在无饲养层细胞添加条件下体外快速扩增的三维动态培养方案，SSCs数量可在培养一周后出现倍增，扩增的SSCs保持未分化特性和定向诱导分化能力，为精原干细胞培养提供了一个理想的增殖环境，能实现规模化扩增。该培养模式下体外增殖的SSCs较好地维持了其未分化状态、表达干细胞标记和诱导分化能力等生物学特性，为进一步深入开展SSC的生物学特性、男性不育以及再生医学方面的应用研究提供种子细胞。

本发明是通过以下技术方案予以实现的：

一种利用FACT Ⅲ微载体体外扩增精原干细胞的三维动态培养方法，包括以下步骤：