[发明专利]一种法夫酵母补糖培养基及其进行高密度培养的方法和应用

说明书

本发明提供了一种法夫酵母补糖培养基及其进行高密度培养的方法和应用，所述补糖培养基含有利于细胞增殖和虾青素合成的碳源组合，能弥补单一碳源产量低的缺点。所述高密度培养方法用在线活细胞传感仪检测活细胞浓度，通过采用指数补料结合溶氧反馈脉冲补料(DO‑STAT补料)的两阶段补糖策略，达到解除克勒勃屈利效应(Crabtree效应)和降低副产物乙醇生成的目的，从而实现法夫酵母细胞的大量增殖和虾青素产量的提高。本发明提供的补糖培养基及高密度培养方法，可大幅提高法夫酵母虾青素产量水平，在100m³发酵罐上虾青素产量为570.0mg/L，适用于商业化生产。

技术领域

本发明涉及微生物发酵技术领域，具体地说是一种法夫酵母补糖培养基及其进行高密度培养的方法和应用。

背景技术

虾青素(Astaxanthin)是一种含氧类胡萝卜素，化学名为3,3′-二羟基-β,β′-胡萝卜素-4,4′-二酮，分子结构中紫罗酮环的3和3′位置各含一个手性(或不对称)中心，故可形成3S-3′S、3R-3′S、3R-3′R(也称为左旋、内消旋、右旋)3种对映异构体。虾青素具有强烈的抗氧化性能，其抗氧化能力是β-胡萝卜素的10倍，比维生素E强百倍以上，被誉为“超级维生素E”，在延缓衰老、提高免疫，防治肿瘤、心血管疾病和糖尿病等方面显示作用。

法夫酵母(Phaffia rhodozyma)作为最具有商业化生产潜能的生产菌株，其抽提物被证明具有安全性，美国食品药品监督管理局(FDA)于2010年增补其用作动物饲料添加剂，亦于2013年进入中国农业部《饲料添加剂品种目录》。随着下游水产养殖规模的扩大，市场对法夫酵母源虾青素的需求日益增长。但法夫酵母生产虾青素存在诸多问题，焦点在于以生产强度、产量水平和原料成本等为主要经济技术指标的参数离商业化生产差距较大。因此，法夫酵母实现工业化生产的关键在于利用基因重组技术对细胞代谢途径进行修饰、改造来改变细胞特性，并整合细胞基因调控、代谢调控及生化工程策略，进一步提升虾青素的生产强度。国内外对法夫酵母发酵相关的技术研究已相当广泛。公布号为CN 108913746A的专利公开了在发酵培养基中添加番茄粉，通过柠檬酸和NaOH控制pH值4.0～6.0，维持葡萄糖浓度15～35g/L，生物量达到65.9g/L，虾青素含量达到81.76mg/L。肖安风等研究了乙醇、乙酸钠、乳酸钠、柠檬酸和甘油这5种糖代谢产物对法夫酵母产虾青素的影响，认为乙酸钠、乳酸钠和柠檬酸对产虾青素有一定的促进作用，当乳酸添加量为1g/L时虾青素浓度最大达到1.54mg/L。YU-ICHI YAMANE等研究了氧含量和葡萄糖供应对法夫酵母初级代谢和虾青素生产的影响，认为呼吸速率与虾青素生产速率正相关，与乙醇生产速率负相关，并得出高C/N比提高虾青素的产量，过高葡萄糖浓度将抑制细胞增殖的结果，在此基础上提出细胞生长期控制低C/N比，虾青素生产期控制高C/N比的两阶段补糖方式。倪辉等报道，自动流加调控pH值比间歇调控pH值更有利于法夫酵母细胞的生长及虾青素合成，1m³发酵罐中试生产生物量及虾青素产量分别达到85.11g/L和279.96mg/L。上述相关研究和技术虽然对产量提高起到一定的作用，但存在以下问题：1)未充分考虑Crabtree效应对菌体生长的深刻影响；2)仅从单一因素的碳源、促进剂或环境因子等进行调控，缺乏生理过程和营养需求的动态、多尺度和全局性分析；3)未充分设计符合菌株生理特性的补料配方，并进行精细而有效的补料控制；

指数补料是希望以指数生长的方式收获菌体的前馈控制式流加方式，流加速率与操作时间呈指数形式变化，但在指数补料后期溶氧难以维持，易出现碳溢流生成乙醇。DO-STAT法以溶氧的急剧上升作为碳源流加的信号，可以将基质(碳源)浓度控制在接近于0的低水平，从而有效地抑制众多代谢副产物的生成，但较长的培养周期影响生产强度。由于虾青素是胞内产物，其产量与生物量和干菌体虾青素含量有关，因此在最佳的培养基成分及含量中保证适宜的温度、pH值、溶氧、电导率等环境条件，通过综合指数补料与DO-STAT补料的特点建立合理的流加培养工艺，降低Crabtree效应以限制或减少有害代谢产物(乙醇)的生成，可以达到高密度培养的目的，进而大幅提高虾青素的生产强度。

发明内容