[发明专利]一种检测非小细胞肺癌患者外周血循环肿瘤细胞EGFR基因突变的试剂盒及检测方法

权利要求书

1.一种检测非小细胞肺癌患者外周血循环肿瘤细胞EGFR基因突变的试剂盒，其特征在于，包括稀释液45mL、脱色液1mL、染色液A 0.5mL、染色液B 1mL、EGFR（小鼠）一抗100μL、山羊抗小鼠 IgG/HRP 100μL、0.1% Triton X-100 100μL、0.3% H₂O₂ 100μL、试剂A 0.5mL、试剂B 1mL、6×PBS缓冲液 60mL；所述PBS缓冲液的pH值为7.4。

2.根据权利要求1所述的试剂盒，其特征在于，所述稀释液是由1mmol/L EDTA+0.1%BSA+0.1%海藻糖+0.2%聚氧乙烯聚氧丙烯醚嵌段共聚物组成，所述基础液为Tris-HCl缓冲剂。

3.根据权利要求1所述的试剂盒，其特征在于，所述脱色液是由95%酒精与100%二甲苯按容积比1:1组成。

4.根据权利要求1所述的试剂盒，其特征在于，所述染色液A为DAB染色液；所述染色液B为苏木素染色液。

5.根据权利要求1所述的试剂盒，其特征在于，所述试剂A为0.6%的羟丙基甲基纤维素水溶液；所述试剂B为乙醇和1，2-丙二醇按照体积比3：1组成。

6.一种利用权利要求1-5任一项所述的试剂盒非诊断目的检测非小细胞肺癌患者外周血循环肿瘤细胞EGFR基因突变的方法，其特征在于，包括以下步骤：

（1）利用膜过滤装置分离获取无法获得组织标本的晚期或复发非小细胞肺癌患者外周血中的CTC：采集无法获取组织标本的晚期或复发非小细胞肺癌患者外周血：肘正中静脉外周血5ml；

（2）外周血样预处理：将采集的外周血样采用稀释液进行10倍稀释，稀释后加多聚甲醛固定外周血样10分钟，固定终浓度为0.25%；

（3）利用膜过滤分离肿瘤细胞装置过滤外周血样，分离获得外周血CTC：将预处理的外周血样加入到膜过滤分离肿瘤细胞装置的血样容器中，使其依靠重力自然过滤；

（4）过滤结束后，从膜过滤分离肿瘤细胞装置中取下滤器，将循环肿瘤细胞染色液A液0.5ml加入到滤器中，染色3min，PBS缓冲液冲洗干净；滤液过滤完全后加入染色液B液1ml，染色2min，纯水1ml冲洗2次，取下滤膜，放置在载玻片上，干燥后在显微镜下观察，确定是否存在CTC；

（5）运用免疫组化技术检测CTC的EGFR表达情况。

7.根据权利要求6所述的检测方法，其特征在于，所述检测CTC的EGFR表达的具体方法如下：

（1）脱色：将带有CTC的滤膜从载玻片上取下，置于脱色液中浸泡4-6小时，脱去CTC染色液；

（2）滴加100μl 0.1% Triton X-100，室温孵育15min，DI水洗2min×3次；

（3）滴加100μl 0.3% H₂O₂，室温孵育10min，PBS洗2min×3次；（4）滴加100μl EGFR（小鼠）一抗，室温孵育2h或4℃过夜，PBS洗2min×3次；

（5）滴加100μl山羊抗小鼠 IgG/HRP，18～26℃温度下孵育20min，PBS洗2min×3次；

（6）滴加100μl DAB显色液，18～26℃孵育并随时在显微镜下观察显色情况，观察时间为3～10min；

（7）显色完成后，弃掉DAB显色液，流水冲洗5min，苏木素染色5min；

（8）盐酸酒精分化8秒，自来水返蓝5min；

（9）将返蓝后的CTC采用75%乙醇（1min），95%乙醇（1min），100%乙醇（1min）梯度乙醇脱水，然后加入0.5mL试剂A，振荡均匀后，加入1mL试剂B，摇动混合均匀后，离心沉淀，将沉淀物采用中性树脂封固；

（10）光学显微镜下镜检。