[发明专利]一种拟穴青蟹呼肠孤病毒-双顺反子病毒的双重快速诊断试剂盒

说明书

本发明公开了一种拟穴青蟹呼肠孤病毒‑双顺反子病毒的双重快速诊断试剂盒，包括扩增反应液及LFD试纸，所述扩增反应液包括如下组分：呼肠孤病毒特异性检测引物和探针；双顺反子病毒特异性检测引物和探针；20mM Tris‑HCl；10mM氯化钾；15mM硫酸铵；8mM硫酸镁；0.1%Triton X‑100；1.6mM dNTP；10U Bst DNA聚合酶大片段。本发明特异性强，灵敏度高，操作简便快捷。

技术领域

本发明涉及水产养殖技术领域，特别涉及一种拟穴青蟹呼肠孤病毒-双顺反子病毒的双重快速诊断试剂盒。

背景技术

拟穴青蟹( Scylla Paramamosain) ，是东南沿海地区重要的海水养殖品种，从其体内分离出的青蟹呼肠孤病毒（Mud crab reovirus，MCRV）可引起蟹的“嗜睡病”，而同时青蟹双顺反子病毒（mud crab dicistrovirus, MCDV）在发病蟹中也经常分离到，这两种病毒对青蟹均具有致病性，导致青蟹养殖过程中大规模发病，给养殖户带来极大地经济损失，给青蟹养殖产业的可持续性发展造成极大影响。为有效地在苗种阶段、养殖中进行快速高效地抽检，降低以致避免病毒的携带和传播，实现病害的阻断防控，在对比现有检测方法的基础上，进一步优化和创新检测技术，力求实现对两种病毒的现场快速诊断。

青蟹呼肠孤病毒，病毒粒子直径为60~70nm，为双链RNA病毒，基因组由12节段的双链RNA组成，属于呼肠孤病毒科；青蟹双顺反子病毒，病毒粒子直径为20~30nm，为单链RNA病毒，基因组由一条单链RNA组成，具有双顺反子病毒科的特征。这两种病毒对拟穴青蟹都有很强的致病性，是近年来新发现的海水养殖蟹重要疾病，主要发生于初夏和入秋后，患病青蟹活动力差、伏于池底、不摄食，解剖可见肠道呈透明状，并可感染梭子蟹和其他海水蟹类。感染后，青蟹的死亡率可高达100%。目前，野生青蟹中存在较高的病毒携带率，这可能是导致人工养殖天然捕捞蟹苗成活率低下的主要原因。目前对于该病的防治主要还是靠病原的检测筛查，普遍采用的是针对MCRV或MCDV的单一特异PCR或双重巢式PCR检测法。但在实际检测工作中，现有的检测技术存在以下问题：一是操作繁琐，对实验人员技术要求高，不利于养殖户和一线生产技术人员来操作；二是对检测设备要求高，养殖企业和基层检测机构无法实现常规检测；三是检测方法耗时长，灵敏度不高，容易漏检。

LAMP-LFD（loop-mediated isothermal amplification with lateral flowdipstick）是一种新型的将核酸等温扩增检测技术与侧向流层析试纸技术相结合，即依据环介导等温核酸扩增技术（LAMP）的原理，针对靶基因的特定区域设计4条特异性引物，利用一种具有链置换特性的DNA聚合酶作用下进行恒温扩增，在等温条件下就可以高效、高特异地扩增靶序列，再通过探针与反应产物杂交，形成三元复合物而在试纸条上显色。单纯针对MCRV的LAMP检测已有报道，采用的是荧光染料观察等方法。而同时检测MCRV-MCDV的LAMP-LFD技术尚未见报道。

发明内容

本发明的目的在于提供一种拟穴青蟹呼肠孤病毒-双顺反子病毒的双重快速诊断试剂盒，特异性强，灵敏度高，操作简便快捷，克服现有检测方法在养殖病害监测中无法直接应用的问题，适合拟穴青蟹“嗜睡病”的筛查与预防。

本发明解决其技术问题所采用的技术方案是：

一种拟穴青蟹呼肠孤病毒-双顺反子病毒的双重快速诊断试剂盒，包括扩增反应液及LFD试纸，所述扩增反应液包括如下组分：

呼肠孤病毒特异性检测引物和探针：0.2mM呼肠孤病毒外引物，1.6mM呼肠孤病毒内引物，0.2mM呼肠孤病毒环引物，0.05mM呼肠孤病毒探针；

双顺反子病毒特异性检测引物和探针：0.2mM双顺反子病毒外引物，1.6mM双顺反子病毒内引物，0.2mM双顺反子病毒环引物，0.05mM双顺反子病毒探针；

20mM Tris-HCl；