[发明专利]一种基于毛细管电泳筛选非天然核酸适体的方法

说明书

本发明公开了一种基于毛细管电泳筛选非天然核酸适体的方法，包括以下步骤：首先合成初始DNA分子随机文库和引物，然后进行循环筛选。在每一轮筛选里，采用引物延伸的方法获得非天然核酸文库，以CTLA‑4为靶蛋白，将非天然核酸文库与靶蛋白共孵育，利用CE‑LIF方法分离结合靶蛋白的非天然核酸分子，然后进行逆转录和PCR扩增，获得富集DNA分子文库，并应用于下一轮筛选。如此重复筛选若干轮，对富集DNA分子进行测序，可推断得到非天然核酸分子的序列信息。最后制备单链非天然核酸分子，测试其与靶蛋白结合的亲和力，获得有特异性的非天然核酸适体。本发明方法能够高效筛选出高亲和力和稳定性的非天然核酸适体，有利于提高功能性核酸在生物环境下的作用效果。

技术领域

本发明涉及一种基于毛细管电泳筛选非天然核酸适体的方法，属于非天然核酸适体筛选技术领域。

背景技术

核酸适体(Aptamer)也被称作适配体、适体、适配子等，是一类单链RNA分子或单链DNA分子，通常由几十到一百多个碱基组成，是从人工合成的RNA或DNA分子随机文库中筛选分离出能与目标物质进行高特异性、高灵敏度结合的单链寡核苷酸。虽然适体的结合方式与抗体较为相似，但核酸适体特有的性质在很多方面都优于抗体。与抗体相比，核酸适体可以通过体外筛选获得，在生产成本、稳定性、修饰难易程度和组织穿透力等方面具有明显优势。在某些应用领域和场景里，核酸适体有望替代抗体，在分子生物学、分析化学以及临床医学等各个领域具有广泛的应用前景。通常，核酸适体是通过指数级富集配体系统进化技术(Systematic evolution of ligands by exponential enrichment，SELEX)筛选得到的。以DNA适体为例，SELEX的基本步骤是将包含大容量的随机寡核苷酸序列的DNA分子随机文库溶液与靶分子共同孵育，并通过各种分离手段将结合靶分子的DNA分子与未结合的DNA分子分离，并对这些能够结合的DNA分子通过聚合酶链式反应进行扩增，经分离为单链后，生成次级文库，再用于下轮筛选，如此重复数轮后，挑选出富集的DNA分子，并进行测序即获得特异性识别靶分子的寡核苷酸分子，即核酸适体。大容量的分子文库能够涵盖丰富多样的立体构象，理论上可以针对任何靶分子进行筛选，得到其特异性识别的核酸适体。

以往筛选出的适体为天然DNA和RNA，在实际应用过程中存在作用时间短、作用效果不理想的情况。而与天然核酸相比，非天然核酸则不仅具有类似的碱基互补配对能力，还具有更好的抗酶切、耐酸、耐热等特性，因而在实际运用场景中具有更高的稳定性和更广泛的应用性。

细胞毒T淋巴细胞相关抗原4(Cytotoxic T lymphocyte-associated antigen-4，CTLA-4)是一种T淋巴细胞跨膜蛋白，它最早在筛选小鼠杀伤性T细胞的cDNA文库时被发现。CTLA-4具有高度的内吞性，通常存在于胞内小体中，以二聚体的形式存在。CTLA-4能够与抗原呈递细胞或者活化的T细胞表面B7受体结合，传导抑制性信号到T细胞，起到抑制T细胞激活的作用，是癌细胞免疫逃逸的一种途径。而相对传统化疗或靶向治疗，生物免疫治疗针对的是免疫细胞或者免疫系统，而不是癌细胞。在癌症免疫治疗中，抑制免疫检查点通路被认为是最有前景的治疗方式之一，其机制是通过抑制通路中相关靶点从而解除T细胞活性受抑的状态，活化后的T细胞能够恢复对肿瘤细胞的攻击。靶向免疫检查点蛋白的抑制剂并不直接作用于肿瘤细胞，而是通过作用于T细胞来间接杀伤肿瘤细胞；另外，它们并不是针对肿瘤表面的某种特定物质，而是系统性地增强了全身的抗肿瘤免疫反应。目前已经获得的CTLA-4抑制剂中，存在易降解，成本高或结合效果不够好的情况。

发明内容

发明目的：为解决上述现有技术中获得的适体存在不稳定，成本高，亲和力不够高的问题，本发明提供了一种基于毛细管电泳筛选非天然核酸适体的方法。

技术方案：为了实现上述目的，本发明采用以下技术方案：