[发明专利]一种腺苷水解酶水解腺苷制备腺嘌呤和D-核糖的方法

说明书

本发明属于生物化工用领域，具体涉及一种腺苷水解酶水解腺苷制备腺嘌呤和D‑核糖的方法。本发明利用腺苷水解酶和中性蛋白酶两种酶通过生物水解法制备腺嘌呤和D‑核糖，其中，利用腺苷水解酶水解腺苷得到腺嘌呤和D‑核糖，进一步利用中性蛋白酶处理体系中残留的腺苷水解酶，而中性蛋白酶可进一步通过水洗的方式去除，与传统的化学合成法和天然产物提取法相比，反应温和，不需要加热，副产物少，产物收率高和纯度高。

技术领域

本发明属于生物化工用领域，具体涉及一种腺苷水解酶水解腺苷制备腺嘌呤和D-核糖的方法。

背景技术

腺嘌呤，化学名为6-氨基嘌呤，化学式为C₅H₅N₅，是核酸的组成成分，参与遗传物质的合成；是很多医药原料及中间体，主要用于生产维生素B₄、植物激素6-苄基腺嘌呤、腺嘌呤核苷、抗乙肝药物阿德福韦酯及泰诺福韦酯等；其磷酸盐能促进白细胞增生，使白细胞数目增加，用于防治各种原因引起的白细胞减少症，特别是用于肿瘤化学治疗时引起的白细胞减少症，也用于急性粒细胞减少症。目前，生产腺嘌呤的方法主要有化学合成法、天然原料提取法和微生物发酵法等。

乙酰次黄嘌呤法是目前国内生产企业使用较多的化学合成方法，例如，CN102321086A公开了乙酰次黄嘌呤和三氯氧磷在N，N-二甲基苯胺的催化下进行氯代反应，得到6-氯嘌呤；在高压釜中，往6-氯嘌呤水溶液中通氨气至饱和，密闭反应釜，升温至120～140℃进行反应直至反应完全，调反应液pH至7～8，冷却，析出腺嘌呤。CN104327081A公开了以乙酰次黄嘌呤为原料，将其分散于1，2-二氯乙烷中，加入无水吡啶和三乙胺，再加入三氯氧磷进行反应，反应结束后，快速过滤，得到中间体；然后将中间体立即加入氨水/甲醇混合液中，进行氨解，制得腺嘌呤。CN107602558A公开了把乙酰次黄嘌呤分散于1，2-二氯乙烷中，然后加入到反应釜，缓慢投入无水吡啶和三乙胺，搅拌升温至110℃～120℃，加入三氯氧磷保温反应50～80min，继续110℃～120℃保温反应4～6h后降温至15℃左右，静至过夜；将上述反应液过滤，再加入混合液中进行氨解，烘干得到腺嘌呤粗品；进一步纯化得到腺嘌呤纯品。上述方法均存在产率较低，使用吡啶、二氯乙烷等大量有毒有害的有机溶剂，且使用三氯氧磷，后处理产生大量废液，反应时间较长、反应条件苛刻等缺点和不足。

天然产物提取法主要是提取天然物种中富集的腺嘌呤。但是目前由于天然宿主腺嘌呤产量低，因此该方法的生产成本高，且提取效率低。吴萍萍等人(吴萍萍,黄丽英,黄丽萍,et al.Analysis of the extraction of adenine from Anoectochilus roxburghi％金线莲中腺嘌呤的提取与分析[J].中国医院药学杂志,2013,033(003):215-218.)公开了应用超声-微波协同萃取技术提取金线莲中的腺嘌呤，其中，提取物中腺嘌呤含量为10.64μg/g。

微生物发酵法生产条件温和，安全性较高，例如，申请号为“CN201810517392.7”的中国专利申请公开了通过在累积腺苷的菌株中引入编码生物酶的基因，获得腺嘌呤生产菌株，通过基因工程手段，实现了细菌体内腺苷(或其前体腺苷酸AMP)向腺嘌呤的转化，从而直接生产出腺嘌呤，但是该方法存在耗时长、效率低、产物难分离等问题。

发明内容

为了克服现有技术的不足和缺点，本发明的目的在于提供一种腺苷水解酶水解腺苷制备腺嘌呤和D-核糖的方法，该方法反应步骤简单、产量高，反应的转化率高达99％，腺嘌呤的收率为99％左右，纯度达到99.85％以上；同时D-核糖的收率也在80％以上，有利于实现产业化。

本发明的目的通过下述技术方案实现：

一种腺苷水解酶水解腺苷制备腺嘌呤和D-核糖的方法，包含如下步骤：

(1)将腺苷和水混合，调节体系pH值至6.5～7.0；然后加入腺苷水解酶，升温至35～37℃并保温反应4～6h；反应完毕后，45～50℃保温处理30～60min；