[发明专利]3-甾酮-1,2-脱氢酶及其应用

说明书

本发明提供了3‑甾酮‑1,2‑脱氢酶及其应用。3‑甾酮‑1,2‑脱氢酶的氨基酸序列为SEQ ID.2。本发明的KsdD211能够催化雄甾‑4‑烯‑3,17‑二酮(4‑AD)反应生成雄甾‑1,4‑二烯‑3,17‑二酮(ADD，1,4‑雄烯二酮)，TLC分析验证了其高酶学活性。HPLC分析KsdD211催化反应表明，KsdD211在18h内完全转化4‑AD生成ADD。

技术领域

本发明涉及生化领域，具体地，涉及3-甾酮-1,2-脱氢酶及其应用。

背景技术

当甾体类化合物导入双键后，如在抗炎甾体激素药物母核的C1,2位导入双键后，能成倍地增加其抗炎作用，如醋酸可的松C1,2位上导入双键后行成的醋酸脱氢可的松，其抗炎作用提高了3-4倍，并且减少了由钠滞留而带来的副作用；还有许多临床上常用的重要甾体化合物的生产，特别是大多数具有抗炎能力的肾上腺皮质激素的生产均涉及到微生物C1,2位的脱氢反应，包括氢化泼尼松(prednisolone)、地塞米松(dexamethasone)、帕拉米松(paramethasone)、倍他米松(batemethasone)、氟可龙(fluocortolone)、氟轻松(fluocinolone)、曲安西龙(triamcinolone)、甲基强的松龙(medrol)等。

3-甾酮-1,2-脱氢酶(KsdD)是一种黄素蛋白依赖型的脱氢酶，在催化反应过程中以黄素腺嘌呤二核苷酸(FAD)为辅因子，可以催化3-甾酮类固醇母核A环1,2位的碳碳单键(C-C)脱氢变成碳碳双键(C＝C)。如下反应过程所示，KsdD催化雄烯二酮(4-AD)的C1,2位脱氢反应生成1,4-雄烯二酮(ADD)。

KsdD酶已经在很多降解甾醇的细菌中被发现，如简单节杆菌，紫红红球菌、睾丸酮假单胞菌、珊瑚诺卡氏菌、耻垢分支杆菌。由于不同来源KsdD酶，他们它们的氨基酸序列不同，蛋白酶构象存在差异性，导致底物的专一性也不同。

从4-AD转化而来的ADD是合成类固醇药物的重要前体，例如避孕药，雌激素和孕激素。尽管化学方法已用于Δ1-脱氢将不饱和度引入醋酸氢化可的松(HA)的1,2-位时，醋酸泼尼松龙(PA)的抗炎活性提高了三到四倍。然而，由于类固醇结构的复杂性，传统的化学方法难以专门修饰类固醇中间体，化学方法存在转化率低，副产物多，环境污染等缺陷。高效酶法工艺制备类固醇中间体，与激素药物的多步化学合成相比，效率高，产物纯度高。因此，酶促转化由于其温和的反应条件，高效率和特异性(区域选择性和立体选择性)而引起了广泛关注。