[发明专利]一种可条件性过表达HPV E7的小鼠成纤维细胞株及其应用

权利要求书

1.一种可条件性过表达HPV E7的小鼠成纤维细胞株，其特征在于，所述小鼠成纤维细胞株的构建包括以下步骤：

步骤一，HPV E7-H11 conditional knock in小鼠原代成纤维细胞分离；

步骤二，HPV E7-H11 cKI小鼠原代成纤维细胞永生化诱导与筛选；

步骤三，永生化-HPV E7-H11 cKI小鼠原代成纤维细胞Cre酶诱导与鉴定。

2.根据权利要求1所述的可条件性过表达HPV E7的小鼠成纤维细胞株，其特征在于，

步骤一，HPV16 E7-H11 conditional knock in小鼠原代成纤维细胞分离

步骤1-1、取经基因型鉴定的同窝6-8周雌性小鼠各一只，安乐死后剪取小鼠尾巴，75％酒精浸泡消毒后转移至超净工作台内，置于装有含1％青霉素/链霉素双抗的磷酸盐缓冲液培养皿中；

步骤1-2、洗去小鼠尾巴表面毛发，手术刀移去表面皮肤，再放入Ca²⁺,Mg²⁺磷酸盐缓冲液中洗3遍，以去除残留血液与脂肪组织，用眼科剪将鼠尾剪成2mm左右的组织小块；

步骤1-3、小心放入六孔板中，六孔板含600μL完全培养液，高糖DMEM+1％双抗+10％胎牛血清，确保组织块均匀且充分贴住六孔板底，置于37℃，5％CO，90％湿度的细胞培养箱培养24h；

步骤1-4、次日补加3mL完全培养基，培养3-5天，每2天换一次液；约8-10天后，细胞可达80-100％接合度，采用差速贴壁法进行消化传代以纯化目的细胞，成纤维细胞完全贴壁时间＜2小时；

步骤二，HPV16 E7-H11 cKI小鼠原代成纤维细胞永生化诱导与筛选

基于步骤1分离所得HPV E7-H11 cKI小鼠原代成纤维细胞，对其进行永生化诱导与筛选：

步骤2-1、永生化病毒包装

步骤2-(1)第一天，取对数生长期HEK-293T铺板，调节细胞浓度至4*10⁶个细胞/dish；

步骤2-(2)第二天，待细胞生长至80％-90％接合度，换液9mL，并按如下比例配制转染体系：1mL opti-MEM中，加入pLenti-SV40 LT-puro质粒10μg，psPAX2 10μg，pMD2.G 5μg，及PEI转染试剂60μL；充分混匀后室温静置20min，随后逐滴加入培养体系中；

步骤2-(3)第三天，细胞换为6mL新鲜培养基；

步骤2-(4)第五天，收集细胞上清，300g离心后，采用0.45μm孔径大小的微孔滤膜过滤病毒液，分装后保存于-80度备用，避免反复冻融；

步骤2-2、细胞永生化诱导

步骤2-(1)待六孔板中原代成纤维细胞接合度至30-50％时，加入2mL病毒液，同时加入促感染剂聚凝胺；

步骤2-(2)次日更换新的病毒液，共复感三次；

步骤2-(3)换回常规培养基，监测细胞生长状况，以含嘌呤霉素的培养基筛选，每三天换液一次；直到抗性群落能被识别出，即对照细胞全部死亡时，继续传代培养筛选得到的细胞；

步骤3，永生化-HPV16 E7-H11 cKI小鼠原代成纤维细胞Cre酶诱导与鉴定

基于步骤2分离所得永生化HPV16 E7-H11 cKI小鼠原代成纤维细胞，对其进行Cre诱导与筛选：

步骤3-1、Cre病毒包装

步骤3-(1)第一天，取对数生长期HEK-293T铺板，调节细胞浓度至4*10⁶个细胞/dish；

步骤3-(2)第二天，待细胞生长至80％-90％接合度，换液9mL，并按如下比例配制转染体系：1mL opti-MEM中，加入CRE-IRES-mCherry质粒10μg，psPAX2 10μg，pMD2.G 5μg，及PEI转染试剂60μL；充分混匀后室温静置20min，随后逐滴加入培养体系中；

步骤3-(3)第三天，细胞换为6mL新鲜培养基；

步骤3-(4)第五天，收集细胞上清，300g离心后，采用0.45μm孔径大小的微孔滤膜过滤病毒液，分装后保存于-80度备用，避免反复冻融；

步骤三、细胞Cre酶诱导

步骤3-1待六孔板中永生化-HPV16 E7-H11 cKI小鼠原代成纤维细胞接合度至30-50％时，加入2mL病毒液，同时加入促感染剂聚凝胺；

步骤3-2次日更换新的病毒液，共复感三次；

步骤3-3换回常规培养基，监测细胞生长状况，有限稀释法挑取荧光克隆，继续扩大培养筛选得到的细胞。