[发明专利]一种能够稳定发光的重组载体的构建方法

说明书

本发明公开了一种能够稳定发光的重组载体的构建方法，包括对荧光素酶基因PCR扩增，制得荧光素酶基因PCR片段；对荧光素酶基因PCR片段进行回收，制得混合液；对混合液进行纯化，制备荧光素酶DNA片段；制备绿色荧光蛋白DNA片段，将绿色荧光蛋白DNA片段和荧光素酶DNA片段与PMD‑18T载体连接，制得初级载体；将初级载体在HD5α感受态细胞中转化，挑选阳性菌落；对阳性菌落进行鉴定，获得能够稳定发光的重组载体；该重组载体的发光性稳定，用重组载体对细胞进行荧光标记后，经过细胞的不断分裂，细胞的荧光强度降低的速率小，进而保证了重组载体的发光稳定性。

技术领域

本发明属于生物技术领域，具体涉及一种能够稳定发光的重组载体的构建方法。

背景技术

表达载体的构建是转基因技术的关键步骤，其主要过程是通过一系列酶切和连接反应将目的基因表达框与载体重组，再将重组后的载体转染宿主细胞，实现目的基因在宿主细胞中的表达，发光重组载体在转染宿主细胞后，会使得宿主细胞出现荧光标记，可以使得操作者对目标细胞或蛋白质进行很好的监测，发光重组载体可以帮助学术研究者，对细菌病毒的感染方式进行研究，但传统的发光重组载体在将目的基因与载体连接的过程中，采用平末端连接法连接，平末端连接法仅适用于与限制性内切酶切割产生的平端和粘端补齐或切平形成的平端，使得重建载体的制备效率较低，传动的发光重组在对细胞进行荧光标记后，经过细胞几代分裂后，荧光强度大大降低，影响了细胞标记跟踪的效果。

发明内容

本发明的目的在于提供一种能够稳定发光的重组载体的构建方法。

本发明要解决的技术问题：

传统的发光重组载体在将目的基因与载体连接的过程中，采用平末端连接法连接，平末端连接法仅适用于与限制性内切酶切割产生的平端和粘端补齐或切平形成的平端，使得重建载体的制备效率较低，传动的发光重组在对细胞进行荧光标记后，经过细胞几代分裂后，荧光强度大大降低，影响了细胞标记跟踪的效果。

本发明的目的可以通过以下技术方案实现：

一种能够稳定发光的重组载体的构建方法，包括如下步骤：

步骤S1：对荧光素酶基因PCR扩增，制得荧光素酶基因PCR片段；

步骤S2：对荧光素酶基因PCR片段进行回收，制得混合液；

步骤S3：将步骤S2制得的混合液进行纯化，制备荧光素酶DNA片段；

步骤S4：制备绿色荧光蛋白DNA片段，将绿色荧光蛋白DNA片段和步骤S3制得的荧光素酶DNA片段与PMD-18T载体连接，制得初级载体；

步骤S5：将步骤S4制得的初级载体在HD5α感受态细胞中转化，挑选阳性菌落；

步骤S6：对步骤S5制得的阳性菌落进行鉴定，获得能够稳定发光的重组载体。

进一步，步骤S1所述的荧光素酶基因PCR扩增的具体步骤如下：将荧光素酶基因、PCR缓冲液、dNTP mix、tap酶加入离心管中，加入双蒸馏水至50μl，将离心管置于PCR仪上，在温度为92-96℃的条件下，进行变性3-5min后，在温度92-96℃，时间40s，温度60-65℃，时间30s，温度70-75℃，时间60s的条件下，进行循环30-35次后，在温度为70-75℃的条件下，进行保温7-10min，制得荧光素酶基因PCR片段；所述的PCR缓冲液为10×PCR缓冲液，dNTPmix为2mM each，tap酶浓度为2U/μl，荧光素酶基因浓度1μg/μl。