[发明专利]一种含泥土检材中微量DNA的提取方法

权利要求书

1.一种含泥土检材中微量DNA的提取方法，其特征在于，包括以下步骤：

（1）裂解：将20mg含泥土检材放入离心管中，加入200-400 μL裂解液，90-100℃金属浴裂解5-15分钟，10000-12000rpm离心2-4分钟后吸取上清液至另一个离心管中，所述裂解液包括3.0-7.0 mol/L异硫氰酸胍、10-40 mmol/L Tris-HCl、5-15 mmol/L 吐温80、2-5mmol/L EDTA和0.05-0.5 mmol/L氨基磷酸酯衍生物，所述裂解液用1 mol/L NaOH溶液将pH值调至7.5-8.5；

（2）向步骤（1）得到的上清液中加入10-20 mg羧酸基阳离子树脂，混匀后，60-90℃金属浴10-20分钟，7000-10000rpm离心2-4分钟，吸取上清液转到另一个离心管中；

（3）DNA吸附：向步骤（2）得到的上清液中加入300-600 μL吸附液和10-20 μL磁珠悬浊液，混匀，磁吸1分钟，吸弃所有液体，所述吸附液包括2.0-5.0 mol/L盐酸胍、10-40 mmol/LTris-HCl和1.5-2.5 mol/L乙二醇，并且所述吸附液通过醋酸-醋酸钠缓冲溶液将pH值调至3-4之间，所述磁珠悬浊液包含分散在高纯水中质量百分比浓度为9%的、尺寸为100-2000nm的二氧化硅磁性复合微粒，所述二氧化硅磁性复合微粒是由两个或更多个铁氧体-二氧化硅核壳纳米粒子交联而成的交联体，并且微粒表面具有多个纳米级尺寸的突起；

（4）洗涤：向离心管中加入200-400 μL洗涤液I，混匀，磁吸1分钟，吸弃所有液体，之后使用800-1000 μL洗涤液II重复上述操作，然后再使用600-800 μL洗涤液III重复上述操作，

所述洗涤液I包括2.0-5.0 mol/L异硫氰酸胍、10-30 mmol/L Tris-HCl和1.5-2.5mol/L乙二醇；

所述洗涤液II包括终浓度为2.0 mol/L的氯化钠、体积百分比为50%的无水乙醇、体积百分比为20%的异丙醇和体积百分比为30%的水；

所述洗涤液III包括体积百分比为50%的无水乙醇和体积百分比为50%的异丙醇；

（5）洗脱：离心管开盖置于65℃金属浴5-10分钟，内容物彻底干燥后，加入10-100 μL的高纯水，混匀，65℃金属浴闭盖10分钟，混匀，磁吸1分钟，吸取DNA溶液保存至另一个离心管中，

所述氨基磷酸酯衍生物为α-氨基磷酸酯、β-氨基磷酸酯和γ-氨基磷酸酯的一种或多种，其中，所述氨基为无取代氨基、一取代氨基或二取代氨基，所述氨基的取代基为脂肪族基团，所述氨基磷酸酯为长度小于5个碳的脂肪醇磷酸酯。

2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述的铁氧体-二氧化硅核壳纳米粒子，其内核是具有超顺磁性的铁氧体纳米粒子，其外壳是二氧化硅。