[发明专利]一种基于第三代测序的单细胞转录组测序方法

说明书

本发明提供了一种基于第三代测序的单细胞转录组测序方法，所述方法包括以下步骤：(1)采用逆转录引物对单细胞RNA进行逆转录，得到带有条形码的cDNA；(2)对带有条形码的cDNA进行PCR扩增，将获得的不同单细胞来源的PCR扩增产物混合；或将不同单细胞来源的带有条形码的cDNA混合后进行PCR扩增；所述逆转录引物从5’端到3’端依次为锚定序列、条形码序列和poly dT。本发明在逆转录引物中添加条形码序列对单细胞全长RNA进行逆转录，实现了对不同单细胞来源的序列进行标记，对不同来源的DNA扩增产物混合达到了第三代测序平台对模板量的要求，利用第三代测序平台实现了对全长转录本的精确测序。

技术领域

本发明属于单细胞测序技术领域，涉及一种基于第三代测序的单细胞转录组测序方法。

背景技术

第二代测序技术(Next-generation sequencing，NGS)的出现将分子生物学研究推向了一个高通量发展的时代，利用NGS产生了大量转录组数据，广泛应用于基础生物学研究和医疗健康领域。传统的测序方法需要大量的起始细胞以获得足够的测序模板，得到的数据也是所有细胞混合的结果，特别是在RNA测序中，细胞间的差异淹没在了平均值中。

单细胞RNA测序技术(scRNA-seq)应运而生，近十年来，基于NGS平台的单细胞转录组测序取得了长足的进步，克服了研究稀有生物材料的挑战，同时揭示了生物样品的异质性，促进了系统发育和癌症异质性等研究领域的发展。Drop-seq(Macosko EZ,etal.Highly Parallel Genome-wide Expression Profiling of Individual Cells UsingNanoliter Droplets.Cell.2015；161(5):1202-1214；Bageritz J,et al.Single-CellRNA Sequencing with Drop-Seq.Methods Mol Biol.2019；1979:73–85；Zheng GX,etal.Massively Parallel Digital Transcriptional Profiling of Single Cells.NatCommun.2017；8:14049.)和Microwell-seq(Codina-Fauteux VA,et al.PHACTR1 SplicingIsoforms and Eqtls in Atherosclerosis-Relevant Human Cells.BMC MedGenet.2018；19(1):97.)等高度并行的scRNA-seq方法使分析人类细胞图谱(HCA)成为可能。然而由于NGS测序平台的技术原因，读长基本不超过500个碱基，对于平均长度为1000个碱基的信使RNA，需要进行测序数据拼接才能推断得到完整的转录本信息，难以获得不同可变剪切的转录本信息。

第三代测序平台(TGS)克服了NGS测序平台读长短的缺点，已经应用于细胞提取总RNA分子的直接测序。然而，TGS测序策略需要大量的原始材料来构建文库，而这些材料无法从单个细胞中直接获得。

发明内容

针对现有技术的不足和实际需求，本发明提供了一种基于第三代测序的单细胞转录组测序方法，所述方法在逆转录阶段对获得的单细胞全长转录本进行条形码标记，并利用第三代测序平台进行测序，可以实现高精度检测单细胞全长转录本的技术效果。

为达此目的，本发明采用以下技术方案：

第一方面，本发明提供了一种单细胞转录组的处理方法，所述方法包括以下步骤：

(1)采用逆转录引物对单细胞RNA进行逆转录，得到带有条形码的cDNA；

(2)对带有条形码的cDNA进行PCR扩增，将获得的不同单细胞来源的PCR扩增产物混合；

或将不同单细胞来源的带有条形码的cDNA混合后进行PCR扩增。

优选地，所述逆转录引物从5’端到3’端依次为锚定序列、条形码序列和polydT。