[发明专利]鉴定长芒苋、糙果苋和沙地苋单粒种子的基于SNP位点的CAPs分子标记及其应用

说明书

本发明涉及分子生物学技术领域，具体涉及鉴定长芒苋、糙果苋和沙地苋单粒种子的基于SNP位点的CAPs分子标记及其应用。本发明的CAPs分子标记如SEQ ID NO.1和SEQ ID NO.2所示，其特异性检测引物如SEQ ID NO.3‑6所示。本发明提供用于区分鉴定单粒长芒苋、糙果苋、沙地苋种子与其他苋属种子的PCR‑RFLP方法。利用本发明提供的CAPs分子标记和PCR‑RFLP方法可实现对长芒苋、糙果苋、沙地苋单粒种子的快速、准确检测鉴定，为口岸快速鉴定检疫性杂草长芒苋、糙果苋、沙地苋提供了可靠的检测方法。

技术领域

本发明涉及分子生物学技术领域，具体涉及鉴定长芒苋、糙果苋和沙地苋单粒种子的基于SNP位点的CAPs分子标记及其应用。

背景技术

检疫性杂草长芒苋、糙果苋和沙地苋隶属苋科苋属异株苋亚属，原产北美，是美国大豆、玉米农田的超级杂草。苋属植物的种子小，仅1mm左右，同属不同种植物的种子形态相近，难以依据种子形态进行有效区分。因此，开发能够实现快速高效鉴定长芒苋、糙果苋和沙地苋单粒种子的分子生物学检测方法对于口岸检测具有重要意义。

单核苷酸多态性(single nucleotide polymorphism，SNP)是指由于单个核苷酸的变异所形成的遗传标记，其数量多、多态性丰富、适于快速、自动化分析。SNP的检测方法有多种，但许多方法由于技术难度高、成本费用高、检测时间较久，阻碍了应用。CAPs(cleaved amplification polymorphism sequence-tagged sites)技术又称为PCR-RFLP，即限制性片段长度多态性聚合酶链反应技术。是使用特异设计的PCR引物扩增目标基因，用专一性的限制性内切酶切割获得特异性条带并进行RFLP分析。PCR-RFLP的应用降低了SNP位点检测成本和难度，同时缩短了检测时间，在2小时内即能获得检测结果，是目前最适用于口岸实验室的检测方法。

发明内容

本发明的目的之一是提供鉴定长芒苋、糙果苋和沙地苋单粒种子的CAPs分子标记，本发明的另一目的是提供鉴定长芒苋、糙果苋和沙地苋单粒种子的引物和试剂盒。

本发明通过对苋属(Amaranthus L.)18个种52份样本的大量关键基因进行扩增、序列分析和比对，分析其系统进化关系及序列差异，发现位于多拷贝核基因ITS序列的SNP位点可区分长芒苋、糙果苋、沙地苋与其他苋属植物种子。基于该SNP位点，结合18S、ITS、26S的序列分析，本发明开发了CAPs分子标记，确定以位于18S以及下游ITS的片段(SEQ IDNO.1)作为区分鉴定长芒苋和其它苋属植物单粒种子的分子标记，以位于26S及其上游ITS的片段(SEQ ID NO.2)作为区分鉴定糙果苋/沙地苋与其它苋属植物单粒种子的分子标记。

具体地，本发明的技术方案如下：

本发明提供用于鉴定长芒苋、糙果苋和沙地苋单粒种子的CAPs分子标记，包括分子标记1和/或分子标记2；分子标记1的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示，SNP位点位于如SEQID NO.1所示序列的第233位，该位点为A/C；分子标记2的核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示；SNP位点位于如SEQ ID NO.2所示序列的第200位，该位点为C/A/T。

上述CAPs分子标记中，对于分子标记1的所述SNP位点，长芒苋种子为A，其它苋属种子为C；对于分子标记2所述SNP位点，糙果苋和沙地苋种子为C，其它苋属种子为A/T。

上述CAPs分子标记中，分子标记1位于18S以及下游ITS，分子标记2位于26S及其上游ITS。分子标记1可有效地将长芒苋与其他苋属植物的单粒种子区分，分子标记2可有效地将糙果苋/沙地苋与其他苋属植物的单粒种子区分。上述CAPs分子标记联用可在苋属植物单粒种子中鉴定出长芒苋、糙果苋、沙地苋的种子。

本发明提供所述CAPs分子标记或其检测试剂在鉴定长芒苋、糙果苋和沙地苋的单粒种子中的应用。