[发明专利]一种钩端螺旋体黏附蛋白rvWFA3-1的制备方法和应用

权利要求书

1.钩端螺旋体黏附蛋白rvWFA3-1在制备治疗问号钩端螺旋体感染疫苗中的应用，所述钩端螺旋体黏附蛋白rvWFA3-1的氨基酸序列如SEQ ID NO.4所示，所述钩端螺旋体黏附蛋白rvWFA3-1通过以下步骤制备得到：

（1）根据问号钩端螺旋体赖株LA_0697基因限制性核酸内切酶图谱分析、信号肽预测结果以及T-A克隆、亚克隆载体多克隆位点，设计含核酸内切酶Nde I或Xho I酶切位点的PCR引物，备用，PCR引物中上游引物的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示，下游引物的核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示；

（2）提取问号钩端螺旋体赖株DNA，具体方法为：将问号钩端螺旋体赖株培养物以转速12000 r/min温度4℃离心15 min，得到沉淀，用0.01 mol/L、pH7.2灭菌PBS洗涤后按上述方法离心，重复2次，得到问号钩端螺旋体沉淀，用细菌基因组DNA制备试剂盒提取DNA；

（3）采用步骤（1）得到的PCR引物和步骤（2）得到的问号钩端螺旋体赖株DNA，扩增LA_0697基因中von Willebrand凝血因子A3区超家族结构域片段，得到扩增片段，扩增方法为：采用EX-Taq高保真PCR试剂盒进行扩增，PCR参数为94℃ 5 min，94℃ 30 s，50℃ 30 s，72℃ 90 s，30个循环，72℃ 7 min，以溴乙锭预染色的1.5%琼脂糖凝胶电泳检测扩增片段后，采用T-A克隆试剂盒将上述目的基因扩增片段与pMD19-T连接，连接过夜后采用氯化钙法将其转化入E. coli DH5α形成E. coli DH5α^pMD19-T0697，蓝白筛选后提取重组质粒pMD19-T⁰⁶⁹⁷测序；

（4）将步骤（3）得到的序列正确的重组质粒pMD19-T⁰⁶⁹⁷与表达载体pET42a用限制性核酸内切酶Nde I和Xho I酶切后回收，T4 DNA连接酶连接形成目的基因重组原核表达质粒pET42a⁰⁶⁹⁷；

（5）采用氯化钙法将步骤（4）得到pET42a⁰⁶⁹⁷转化入感受态E. coli BL21DE3中，形成E.coli BL21DE3^pET42a-0697工程菌株，接种于50 μg/mL卡那霉素LB琼脂平板上分离培养，0.5mmol/L的IPTG诱导，分离培养和IPTG诱导条件为：以转速220 r/min、37℃震荡培养，至A₆₀₀值为0.6～0.8时加入0.5mmol/L的IPTG，以上述条件继续培养6 h，诱导目的重组蛋白rvWFA3-1表达，获得目的重组蛋白 rvWFA3-1，采用Ni-NTA亲和层析柱提纯rvWFA3-1。

2.钩端螺旋体黏附蛋白rvWFA3-1在制备钩端螺旋体感染抗体检测试剂盒中的应用，所述钩端螺旋体黏附蛋白rvWFA3-1的氨基酸序列如SEQ ID NO.4所示，所述钩端螺旋体黏附蛋白rvWFA3-1通过以下步骤制备得到：

（1）根据问号钩端螺旋体赖株LA_0697基因限制性核酸内切酶图谱分析、信号肽预测结果以及T-A克隆、亚克隆载体多克隆位点，设计含核酸内切酶Nde I或Xho I酶切位点的PCR引物，备用，PCR引物中上游引物的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示，下游引物的核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示；

（2）提取问号钩端螺旋体赖株DNA，具体方法为：将问号钩端螺旋体赖株培养物以转速12000 r/min温度4℃离心15 min，得到沉淀，用0.01 mol/L、pH7.2灭菌PBS洗涤后按上述方法离心，重复2次，得到问号钩端螺旋体沉淀，用细菌基因组DNA制备试剂盒提取DNA；

（3）采用步骤（1）得到的PCR引物和步骤（2）得到的问号钩端螺旋体赖株DNA，扩增LA_0697基因中von Willebrand凝血因子A3区超家族结构域片段，得到扩增片段，扩增方法为：采用EX-Taq高保真PCR试剂盒进行扩增，PCR参数为94℃ 5 min，94℃ 30 s，50℃ 30 s，72℃ 90 s，30个循环，72℃ 7 min，以溴乙锭预染色的1.5%琼脂糖凝胶电泳检测扩增片段后，采用T-A克隆试剂盒将上述目的基因扩增片段与pMD19-T连接，连接过夜后采用氯化钙法将其转化入E. coli DH5α形成E. coli DH5α^pMD19-T0697，蓝白筛选后提取重组质粒pMD19-T⁰⁶⁹⁷测序；

（4）将步骤（3）得到的序列正确的重组质粒pMD19-T⁰⁶⁹⁷与表达载体pET42a用限制性核酸内切酶Nde I和Xho I酶切后回收，T4 DNA连接酶连接形成目的基因重组原核表达质粒pET42a⁰⁶⁹⁷；

（5）采用氯化钙法将步骤（4）得到pET42a⁰⁶⁹⁷转化入感受态E. coli BL21DE3中，形成E.coli BL21DE3^pET42a-0697工程菌株，接种于50 μg/mL卡那霉素LB琼脂平板上分离培养，0.5mmol/L的IPTG诱导，分离培养和IPTG诱导条件为：以转速220 r/min、37℃震荡培养，至A₆₀₀值为0.6～0.8时加入0.5mmol/L的IPTG，以上述条件继续培养6 h，诱导目的重组蛋白rvWFA3-1表达，获得目的重组蛋白 rvWFA3-1，采用Ni-NTA亲和层析柱提纯rvWFA3-1。