[发明专利]一种短链脱氢酶及应用

说明书

本发明属于生物技术领域，公开了一种从枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)中挖掘到的短链脱氢酶基因、短链脱氢酶BsSDR10、工程菌及其作为催化剂在不对称还原前手性羰基化合物以制备光学活性手性醇中的应用。该酶具有立体专一性，反应条件温和，操作简便等优势，在含有手性药物中间体的生产中具有很好的应用前景。

技术领域

本发明属于生物工程技术领域，具体涉及一种短链脱氢酶及其基因，含有该基因的重组表达载体和重组表达转化体，该重组酶的制备方法，以及该短链脱氢酶作为催化剂在不对称还原前手性羰基化合物以制备光学活性手性醇中的应用。

背景技术

手性醇是许多畅销药物及手性化学品的重要中间体。例如(R)-2-氯-1-苯乙醇(分子式为C₈H₉ClO，分子量156.61，CAS号：56751-12-3)是合成β3-肾上腺素能受体激动剂米拉贝隆的重要中间体。米拉贝隆作用于膀胱逼尿平滑肌β3肾上腺素受体，使膀胱舒张，促进膀胱充盈并增加储尿量，延长排尿间期，同时抑制膀胱传入神经，主要用于治疗尿频、尿急、排尿困难。(R)-邻氯扁桃酸甲酯(分子式为o-Cl-C₆H₄CH(OH)COOCH₃，分子量为200.62，CAS号：32345-59-8)是合成血小板聚集抑制剂氯吡格雷的重要手性中间体。氯吡格雷是一种二磷酸腺苷(ADP)受体阻滞剂，可与血小板膜表面ADP受体结合，使纤维蛋白原无法与糖蛋白GPⅡb/Ⅲa受体结合，从而抑制血小板凝集，主要用于治疗急性心肌梗死，在国内具有广泛市场。因此，研究上述光学纯手性醇的手性合成制备具有广阔的应用前景。

光学活性手性醇的合成有化学法和生物法两种。与化学方法相比，生物法具有反应条件温和、转化率高、对映体选择性高等多种优点，尤其生物催化的羰基不对称还原反应在手性醇合成中的应用越来越受到重视。

米拉贝隆重要中间体(R)-2-((4-硝基苯乙基)氨基)-1-苯乙醇主要通过化学方法合成。一种以(R)-氧化苯乙烯为原料，该路线4-硝基苯乙胺与(R)-氧化苯乙烯经开环反应生成开环化合物，再经Pd/C催化还原硝基生成(R)-2-((4-硝基苯乙基)氨基)-1-苯乙醇。但是氧化的开环反应收率非常低(20％-30％)(专利WO9920607A1，CN103896872A,US6346532B1)。第二种以(R)-扁桃酸为原料，与4-硝基苯乙胺盐酸盐反应再还原生成(R)-2-((4-硝基苯乙基)氨基)-1-苯乙醇,第二步酰胺还原需要用到昂贵的甲硼烷-四氢呋喃与1，3-二甲基咪唑啉酮(DMI)(EP1440969,EP1559427,WO2015044965A1)。

(R)-邻氯扁桃酸甲酯的生物不对称合成方法主要有羰基还原酶催化的邻氯苯甲酰甲酸酯的不对称还原以及腈水解酶催化的邻氯扁桃腈的不对称水解。马宏敏等用筛选的光滑假丝酵母(Candida glabrata)等菌株，在水/有机相体系中催化邻氯苯甲酰甲酸甲酯收率87％，产物ee值为98％，反应时间长达6h(中国专利，公开号CN102618513A)。张志钧等用粪产碱杆菌(Alcaligenes sp.ECU0401)来源的腈水解酶在水-甲苯两相体系中催化邻氯扁桃腈的动态动力学水解拆分制备(R)-邻氯扁桃酸，底物浓度为200mM,产物的对映体过量值(ee)为90.4％，产量为76.5％(J.Biotechnol.2011,152,24-29)。

因此针对上述的化合物及其类似化合物，寻找一种羰基还原酶能够催化高底物浓度下的高立体选择性不对称还原，不添加或者添加极少量辅酶，经济易得，无疑具有极其重大的意义。

短链脱氢酶(Short-chian dehydrogenase.SDRs)是一类利用NADPH作为氢供体将羰基化合物还原成相应的手性醇的羰基还原酶。家族成员由250-300个氨基酸残基组成，序列相似度仅为15％～35％，并且蛋白质三维结构具有典型的Rossmann折叠结构域。

发明内容