[发明专利]一种钩端螺旋体黏附蛋白rvWFA3-2的制备方法和应用

权利要求书

1.一种钩端螺旋体黏附蛋白rvWFA3-2的制备方法，其特征在于包括以下步骤：

（1）根据问号钩端螺旋体赖株LA_4207基因限制性核酸内切酶图谱分析、信号肽预测结果以及T-A克隆、亚克隆载体pET42a多克隆位点，设计含核酸内切酶Nde I或Xho I酶切位点的PCR引物，备用，PCR引物中上游引物的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示，下游引物的核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示；

（2）提取问号钩端螺旋体赖株DNA，将问号钩端螺旋体赖株培养物以12000 r/min， 4°C离心15 min，得到沉淀，用0.01 mol/L、pH7.2灭菌PBS洗涤后按上述方法离心，重复2次，得到问号钩端螺旋体沉淀，用细菌基因组DNA制备试剂盒提取DNA；

（3）采用步骤（1）得到的PCR引物和步骤（2）得到的问号钩端螺旋体赖株DNA，扩增LA_4207基因中凝血因子A3区超家族结构域片段，得到目的基因扩增片段，以溴乙锭预染色的1.5%琼脂糖凝胶电泳检测扩增片段后，采用T-A克隆试剂盒将上述目的基因扩增片段与pMD19-T连接，扩增方法为：采用EX-Taq高保真PCR试剂盒进行扩增反应，PCR参数为94°С 5min，94°С 30 s，50°С 30 s，72°С 90 s，30个循环，72°С 7 min，连接过夜后采用氯化钙法将质粒转化入感受态E. coli DH5α形成E. coli DH5α^pMD19-T4207，蓝白筛选后提取重组质粒pMD19-T⁴²⁰⁷测序；

（4）将步骤（3）得到的测序结果目的基因序列正确的重组质粒pMD19-T⁴²⁰⁷与表达载体pET42a用限制性核酸内切酶Nde I和Xho I酶切后回收，在T4 DNA连接酶作用下连接，形成重组原核表达质粒pET42a⁴²⁰⁷；

（5）采用氯化钙法将pET42a⁴²⁰⁷转化入感受态E. coli BL21DE3中形成E.coliBL21DE3^pET42a-4207工程菌株，接种于50 μg/mL卡那霉素LB琼脂平板上分离培养，0.5 mmol/L的IPTG诱导，获得目的重组蛋白rvWFA3-2，采用Ni-NTA亲和层析柱提纯rvWFA3-2；分离培养和IPTG诱导方法为：在220 r/min、37°С条件下震荡培养，至A₆₀₀值为0.6～0.8时加入0.5mmol/L的IPTG，按上述方法继续培养6 h，诱导目的重组蛋白rvWFA3-2表达。

2.钩端螺旋体黏附蛋白rvWFA3-2在制备治疗问号钩端螺旋体感染疫苗中的应用，所述钩端螺旋体黏附蛋白rvWFA3-2的氨基酸序列如SEQ ID No.4所示。

3.钩端螺旋体黏附蛋白rvWFA3-2在制备钩端螺旋体感染抗体检测试剂盒中的应用，所述钩端螺旋体黏附蛋白rvWFA3-2的氨基酸序列如SEQ ID No.4所示。